研究背景

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是一種非常普遍的慢性睡眠障礙，以睡眠中反復(fù)出現(xiàn)的部分或完全咽部塌陷為特征，伴有慢性間歇性缺氧（CIH）。OSA被認(rèn)為是發(fā)生全身性高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，OSA引起高血壓的確切機(jī)制尚不完全清楚。有證據(jù)表明，血管內(nèi)皮功能障礙是OSA心血管并發(fā)癥前最早期的臨床表現(xiàn)。因此，對(duì)CIH狀態(tài)下內(nèi)皮功能障礙的分子機(jī)制進(jìn)行整體分析，有助于全面了解OSA或CIH相關(guān)性高血壓的發(fā)病機(jī)制。

近日，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院北京心肺血管疾病研究所張慧娜研究員作為第一作者和通訊作者，在Theranostics（IF: 11.556）期刊發(fā)表了題為“Extracellular vesicle-derived miR-144 as a novel mechanism for chronic intermittent hypoxia-induced endothelial dysfunction”的論文，文章結(jié)果不僅擴(kuò)大了涉及血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的血源性物質(zhì)的范圍，同時(shí)提示負(fù)載anti-miR-144的細(xì)胞外囊泡可作為一種潛在的治療阻塞性睡眠呼吸暫?；蚵蚤g歇性缺氧相關(guān)內(nèi)皮功能障礙的方法。

研究結(jié)果

慢性間歇性缺氧可引起內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)超氧陰離子自由基的產(chǎn)生，抑制NRF2的表達(dá)

為了確定CIH誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制，作者用表達(dá)譜芯片檢測(cè)C57BL/6小鼠在常氧(N)、CIH (C)和30天CIH后15天常氧（Re-Nor post-CIH）條件下主動(dòng)脈中差異表達(dá)的基因。在CIH和常氧(N)中發(fā)現(xiàn)了743個(gè)顯著差異表達(dá)的編碼基因，在Re-Nor post-CIH組中伴隨有逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)，其中只有NRF2基因同時(shí)與血管收縮和擴(kuò)張、活性氧生成、炎癥和血管生成相關(guān)（圖1B-C）。經(jīng)過WB驗(yàn)證，CIH暴露30天的C57BL/6小鼠主動(dòng)脈中NRF2及其下游靶點(diǎn)CATALASE (CAT)水平顯著降低，Re-Nor post-CIH組恢復(fù)（圖1D）。

圖1 | CIH處理會(huì)損害內(nèi)皮依賴性舒張（EDR），降低NRF2的表達(dá)，促進(jìn)超氧陰離子的產(chǎn)生

CIH處理的C57BL/6小鼠血清EVs (CIH S-EVs)損害內(nèi)皮功能，增加超氧陰離子的產(chǎn)生，降低NRF2表達(dá)

作者首先用透射電鏡、標(biāo)記蛋白評(píng)估了S-EVs的特征，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CIH S-EVs的數(shù)量大約是常氧組的2倍（圖2A-D）。隨后，作者發(fā)現(xiàn)CIH血清處理48小時(shí)可以減弱小鼠主動(dòng)脈中的EDR，而無EV血清處理則沒有這種抑制作用。直接暴露于CIH S-EVs 48小時(shí)可以減弱C57BL/6小鼠胸主動(dòng)脈中的EDR，減少C57BL/6小鼠腸系膜動(dòng)脈中的血流介導(dǎo)擴(kuò)張。染色實(shí)驗(yàn)顯示S-EVs可以被主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞吸收（圖2E）。

圖2 | C57BL/6小鼠血清中分離的EVs可被主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞吸收

為了進(jìn)一步明確CIH S-EVs是如何對(duì)EDR產(chǎn)生不利影響的，作者使用表達(dá)譜芯片來檢測(cè)CIH S-EVs或Nor S-EVs處理的HUVECs中差異表達(dá)的基因，兩組間有19個(gè)顯著差異表達(dá)的編碼基因（圖3D）。其中，只有NRF2同時(shí)是前期CIH處理小鼠主動(dòng)脈比較組中的差異表達(dá)基因（圖3D）。

進(jìn)一步的驗(yàn)證表明，CIH S-EV體外處理確實(shí)降低了NRF2及其靶點(diǎn)CAT在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系H5V和小鼠主動(dòng)脈中的蛋白表達(dá)（圖3E）。此外，CIH S-EV處理可增加H5V細(xì)胞和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中超氧陰離子的產(chǎn)生，而ROS清除劑可阻斷這一作用，這表明NRF2的降低可能是CIH S-EVs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子過量產(chǎn)生的主要分子（圖3F-G）。

圖3 | CIH S-EVs損害內(nèi)皮功能，增加超氧陰離子的產(chǎn)生，降低NRF2表達(dá)

miR-144在CIH S-EVs中升高

為了確定CIH S-EVs降低NRF2和損傷內(nèi)皮功能的機(jī)制，作者通過qPCR檢測(cè)了常氧和CIH處理的小鼠S-EVs中與氧化應(yīng)激或缺氧信號(hào)相關(guān)的miRNAs。在CIH S-EVs中，miR-126水平降低，而miR-132、miR-150、miR-27a和miR-144水平升高（圖4A）。過表達(dá)miR-144和miR-27a可以降低H5V中NRF2及其靶點(diǎn)CAT的蛋白水平（圖4C），并抑制293A細(xì)胞中NRF2 3’ UTR的熒光素酶活性（圖4D）。

間歇性缺氧(IH)處理H5V細(xì)胞24小時(shí)后，qPCR結(jié)果顯示，miR-27a在內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)，并對(duì)IH刺激做出反應(yīng)（圖4E-F）。在H5V細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到miR-144的表達(dá)，但CIH S-EVs處理顯著增加了H5V細(xì)胞中miR-144的豐度，提示內(nèi)皮細(xì)胞miR-144信號(hào)主要來自S-EVs（圖4G-H）。因此，作者選擇EV miR-144作為進(jìn)一步研究的靶分子。

圖4 | miR-144在CIH S-EVs中增加，并通過S-EVs傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞

CIH暴露小鼠的紅細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡（CIH E-EVs）中miR-144升高

為了明確miR-144在CIH S-EVs中的細(xì)胞來源，通過超離心從C57BL/6小鼠紅細(xì)胞中分離紅細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡（E-EVs），通過透射電鏡、納米顆粒跟蹤分析、標(biāo)記蛋白等鑒定E-EVs(圖5A-C)。qPCR檢測(cè)顯示，在CIH處理的C57BL/6小鼠紅細(xì)胞和OSA患者紅細(xì)胞中的E-EVs中，miR-144均顯著上調(diào)(圖5D-E)。

圖 5｜分離的E-EVs和miR-144在E-EVs中的表達(dá)特征

HIF-1α和GATA1介導(dǎo)CIH E-EVs中miR-144的上調(diào)

為了進(jìn)一步證明EV介導(dǎo)的紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞交流，作者檢測(cè)C57BL/6小鼠在常氧(N)、CIH (C)和30天CIH后15天常氧（Re-Nor post-CIH）條件下紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中pri-miR-144和成熟miR-144的水平。結(jié)果顯示，CIH組中紅細(xì)胞中pri-miR-144和miR-144表達(dá)均顯著升高，在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，只有miR-144上調(diào)（圖6A-B），這表明內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-144極有可能從體內(nèi)的紅細(xì)胞外源性轉(zhuǎn)移。

小鼠紅細(xì)胞白血病(MEL)細(xì)胞在連續(xù)缺氧、間歇性缺氧或DMOG（HIF-1α穩(wěn)定劑）后miR-144上調(diào)（圖6C）。作者突變了miR-144啟動(dòng)子上的GATA1結(jié)合位點(diǎn)，并研究了間歇性缺氧和HIF-1α敲低對(duì)突變的miR-144啟動(dòng)子活性的影響（圖6D-I）。結(jié)果表明，缺氧過程中miR-144可直接受HIF-1α調(diào)控或間接受HIF-1α/GATA1通路調(diào)控。

圖6｜間歇性缺氧紅細(xì)胞中miR-144的表達(dá)與調(diào)控

Anti-miR-144阻斷CIH E-EVs誘導(dǎo)的NRF2表達(dá)、超氧陰離子產(chǎn)生和內(nèi)皮功能障礙

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CIH E-EVs傳遞miR-144對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，作者使用anti-miR-144和anti-miR-144負(fù)載的CIH E-EVs體外治療主動(dòng)脈或在體內(nèi)治療CIH小鼠。體內(nèi)CIH E-EV處理增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子的產(chǎn)生，但是在anti-miR-144負(fù)載的CIH E-EV處理組中被很大程度上抑制（圖7C-D）。同時(shí)，體內(nèi)CIH E-EV處理會(huì)引起EDR受損，收縮壓升高。這些效應(yīng)在anti-miR-144負(fù)載的CIH E-EVs處理組中減弱（圖7E-F）。antagomiR-144顯著逆轉(zhuǎn)了來源于CIH小鼠或OSA患者的E-EV引起的內(nèi)皮功能障礙（圖7G-H）。

圖7｜Anti-miR-144阻斷CIH E-EVs誘導(dǎo)的NRF2表達(dá)、超氧陰離子產(chǎn)生和內(nèi)皮功能障礙

研究結(jié)論

本研究系統(tǒng)地證明了CIH S-EVs和CIH E-EVs可以向內(nèi)皮細(xì)胞傳遞功能性的miR-144，通過降低NRF2表達(dá)促進(jìn)超氧陰離子的產(chǎn)生。本研究為負(fù)載anti-miR-144或antagomir-144 EV治療OSA或CIH相關(guān)血管并發(fā)癥提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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