一.通常我們在分析天然藥物成分的時候結構復雜，無法考察組分的PKa值，哪我們?nèi)绾稳ミx擇最合適的流動相或者是拖尾該怎么改善呢？

? ? ? ?答：如果天然產(chǎn)物中沒有易電離的極性基團，就不需要用緩沖鹽調(diào)節(jié)pH。如果天然產(chǎn)物中既有酸性基團，也有堿性基團，譬如有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的兩性物質(zhì)，建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4（如果是諸如月旭的Ultimate LP-C18這樣的耐酸色譜柱，還可以調(diào)得更低）。

? ? ? ?如果pH控制在6.2-9.0之間，兩個基團都處于離子態(tài)，保留能力最差，是最不可取的。如果不清楚復雜物質(zhì)中含有什么基團，也請將pH調(diào)到2.4或更低。因為pH調(diào)低，起碼抑制了酸性基團的電離而處于中性分子狀態(tài)，而增加酸性基團這個部分在反相色譜中的保留能力；另外低pH還抑制了硅醇基的活性，有利于獲取對稱的峰形。

? ? ? ?情況不明時候，為什么不建議調(diào)高pH呢？一方面一般色譜柱都不能承受pH9以上的條件；即使是像月旭的Xtimate系列一樣能耐12.5的柱子，調(diào)高pH和調(diào)低pH相比，還有一個硅醇基活性大的劣勢。

二.記得以前拿到C18柱，會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，這樣做的目的是什么呢？是先用溶劑活化嗎？然后再用樣品？還有測定短肽總是沖出來，該怎么解決呢？就是和溶劑峰出在一起，或者出在溶劑峰之前。

?? ? ? ?答：C18柱，會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，因為色譜柱到達用戶手中時，時間長短不一，在存儲和運輸?shù)倪^程中，可能存儲液有些揮發(fā)，低流速的甲醇可以很好的浸潤固定相，使鍵合相很好的伸展，用溶劑平衡好系統(tǒng)后，可以采取多次進樣或者加大進樣量的方式以更快的獲得重現(xiàn)的色譜圖，這樣用樣品將色譜柱中的活化點飽和，就不會出現(xiàn)異常色譜現(xiàn)象的情況。

三.C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中，會對柱子有什么損壞嗎？ph在2左右。

? ? ? ?答：pH2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失，包括C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽，如果不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動相中，也不必過份擔心，最多相當于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧；有緩沖鹽就麻煩一點，保存期間水分揮發(fā)可能會導致緩沖鹽結晶在柱內(nèi)析出，對柱子損傷很大。

四.色譜柱的安裝有什么技巧嗎？只要保證不漏就行了嗎？還有所謂的死體積怎么測定呢？

? ? ? ?答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是完全不保留的物質(zhì)出峰時從進樣到流過色譜柱的總體積，一般用極性非常強的尿嘧啶的出峰來測定。死體積包括柱體積（色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積）和柱外體積兩部分。

? ? ? ?你從廠商這里買到色譜柱，柱體積已經(jīng)是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進樣器內(nèi)死體積、毛細管長度、毛細管和色譜柱連接緊湊與否，保護柱或在線濾器產(chǎn)生的死體積大小，都對這個有影響。樣品在柱內(nèi)，除擴散外，還有和填料作用引起的組分分離；但樣品在柱外，那就只有擴散這個使柱效下降的因素了。所以，要取得好的分離效率，柱外體積應該是越小越好。

? ? ? ?峰有時候前延，有時候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關鍵就是色譜條件的選擇。包括進樣量、樣品溶劑、流動相組成（包括添加劑）、流動相pH以及柱溫，都對峰形有影響。另外測定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會不正常。所以最好把你具體的測定條件也列一下，也便于有針對性的分析原因。

五.測定多肽樣品時，十幾肽或者二十幾肽時，有時峰前延的比較厲害，有時峰拖尾比較厲害，這是什么原因呢？是樣品的問題還是柱子的問題？

? ? ? ?答：峰有時候前延，有時候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關鍵就是色譜條件的選擇。包括進樣量、樣品溶劑、流動相組成（包括添加劑）、流動相pH以及柱溫，都對峰形有影響。另外測定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會不正常。所以最好把你具體的測定條件也列一下，也便于有針對性的分析原因。

總結

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