細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、真菌污染、支原體污染、黑膠蟲污染、原蟲污染、病毒污染以及非細胞污染。

怎樣判斷你的細胞是何種生物性污染?

01、細菌

細菌種類繁多，分布廣泛，是最容易污染細胞的微生物。

1、常見細菌種類為大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌等(革蘭陰性菌)、葡萄球菌等(革蘭陽性菌)，其中革蘭陽性菌較為多見。

2、主要來源：操作不當或是器材消毒不嚴，或是各種營養(yǎng)成分隱性污染細菌沒有被檢測出來所造成的。

3、特點：污染速度快，易被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)情況下細胞培養(yǎng)液短時間內(nèi)變黃，培養(yǎng)基1～2d就會變渾濁，pH值降低，倒置顯微鏡下觀察，可見胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細胞變圓或崩潰，從壁上脫落，培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，呈細沙狀，污染較輕時可見小菌體在細胞間運動。

4、處理措施

①在培養(yǎng)液中添加雙抗（P/S）處理；可用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48h后再換常規(guī)培養(yǎng)液；

②另外添加西司他丁鈉和亞胺培南處理細胞，適用于培養(yǎng)用具被打翻、使用了污染的培養(yǎng)液或要培養(yǎng)污染的組織或者凍存細胞的污染情況。

③裸鼠體內(nèi)接種法是比較有效和徹底的除菌方法。主要包括腹水接種和皮下荷瘤分離細胞。既能徹底清除污染細菌，又能保持腫瘤細胞的來源特征和惡性特性。對于一些特別珍貴的腫瘤細胞，可采用裸鼠體內(nèi)接種法。

02、真菌

1、真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其是在梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

2、主要來源：實驗人員(實驗服)

3、特點

短期內(nèi)不會引起培養(yǎng)液的渾濁，可在培養(yǎng)液中形成白色或黃色漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，4d左右才可在高倍鏡下觀察到絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有些真菌開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。

念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間（發(fā)生卵圓形物體污染的幾率很大）。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落而亡。

4、處理措施

① 添加制霉菌素和兩性霉素B，但是對細胞的毒性也較大；

② 環(huán)境徹底消毒：先后用酒精、新潔爾擦洗培養(yǎng)箱；水盤加上飽和量的硫酸銅。

③ 若細胞不是特別珍貴，建議丟棄。

03、支原體

1、支原體是介于細菌與病毒之間(直徑在0.13～0.18 μm)能獨立生活的最小微生物，結(jié)構(gòu)簡單，多數(shù)呈球形，可穿過0.22 μm 的孔徑濾膜！光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并對青霉素有抗藥性！多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。

2、主要來源：血清

3、特點

支原體污染不能用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢查細胞觀察出來，帶有一定的隱蔽性，易被人們忽視。當細胞被支原體污染后，在光鏡下?？梢姷郊毎思鞍麧{內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒或空泡，細胞營養(yǎng)液可能毫無變化，短期內(nèi)細胞沒有明顯的病理變化，也可以因為傳代或換液而緩解。只有當污染嚴重時才影響細胞增殖，使細胞脫落。支原體可以與宿主細胞形成一個共生關(guān)系，使污染不斷擴大。

4、檢測

常用的檢查方法為培養(yǎng)檢測法，即取1mL細胞培養(yǎng)液加入支原體液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天后，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。如果變黃則懷疑該細胞受到支原體污染。如果不變色，則盲傳一代。

若顏色變黃，可接支原體固體培養(yǎng)基，于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天，觀察有無“煎蛋”狀支原體菌落。一旦發(fā)生污染即淘汰該細胞和培養(yǎng)液。

此外，支原體污染還可用熒光染色法和相差顯微鏡觀察法等檢測方法,或者直接購買支原體檢測試劑盒進行檢測。

5、處理措施

① 用MRA處理

用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細胞純潔健康，效果好。

② 用清洗純化法清除支原體污染的方法

細胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選→細胞清洗→反復(fù)離心洗滌

其原理是利用離心力、細胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限。

如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

③ 藥物輔助加溫處理

先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。

④ 使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟。

04、黑膠蟲

1、黑蛟蟲是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界還有爭論?？梢源┩笧V膜，也可以通過空氣傳播。

2、主要來源：血清

3、特點

開始污染時對細胞無影響，當數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產(chǎn)生影響。400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體。培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。

4、處理措施：

更換血清；增加細胞密度，提高細胞的生長率。

05、病毒

1、盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

2、主要來源：動物血清或者細胞系，常見于雜交瘤細胞。

3、特點：極為隱蔽，很難用常規(guī)的方法檢測到。受病毒污染的細胞液通常清亮無變化，大多數(shù)受病毒污染的細胞不會產(chǎn)生形態(tài)變化及細胞病理現(xiàn)象，少部分病毒會造成細胞變圓、腫脹，脫落。

4、檢測：可用血細胞吸附試驗、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒。通常病毒物污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質(zhì)量的細胞株。

06、原蟲

培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且 細胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細胞不透亮 。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細胞占優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數(shù)量時就會影響到細胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。

07、非同種細胞污染

即是細胞交叉污染，由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致 。

細胞一旦發(fā)現(xiàn)有污染出現(xiàn)，應(yīng)及時對所用試劑和耗材進行清理。耗材可更換新的或者重新高壓滅菌，試劑可重新過濾除菌或者更換新批次，操作臺和細胞房需用消毒液進行全面清潔消殺后方可復(fù)蘇新的細胞，以免反復(fù)出現(xiàn)污染。

細胞培養(yǎng)房全面消殺的工作，如果沒有借助自動化消毒機恐怕會很費力氣，浪費人力不說，還有可能會出現(xiàn)消毒不到位的情況，無法徹底清除污染，存在反復(fù)污染風(fēng)險。那么全自動消毒機用哪種方式比較好呢。

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