2022年11月9日，Nature?在線發(fā)表了北京大學第一醫(yī)院腫瘤轉化研究中心張寧團隊與北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）張澤民團隊、北京大學人民醫(yī)院肝膽外科朱繼業(yè)團隊緊密合作的研究成果，綜合解析了肝癌的免疫微環(huán)境亞型和中性粒異質性。該研究清晰界定了五種肝癌免疫微環(huán)境亞型，為肝癌生物標志物探索提供了數(shù)據(jù)，明確表述了大部分腫瘤相關中性粒亞群的免疫抑制功能，為潛在免疫治療手段提供了線索。該研究中的單細胞轉錄組測序服務由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Nature

【影響因子】69.504

【發(fā)表單位】北京大學

研究背景

原發(fā)性肝癌（PLC）分為三種組織學亞型：肝細胞癌（HCC）、肝內膽管癌（ICC）和混合型肝細胞癌—膽管癌（CHC）。目前對于 PLC 的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）基線了解有限，界限不清晰，阻礙了肝癌患者生物標志物的發(fā)現(xiàn)。肝癌研究亟需對臨床信息充分的多種 PLC 亞型患者進行單細胞研究來解析腫瘤中的全部細胞類型。另外，關于腫瘤中的中性粒細胞是促癌還是抑癌作用仍存在爭議，沒有研究對于腫瘤中的中性粒異質性進行全面解析。

研究思路

主要結論

1、大規(guī)模肝癌患者單細胞圖譜

研究對來自 124 例未治療的肝癌患者的 160 個樣本進行了單細胞轉錄組測序，包括 79 名 HC 例患者，25 例 ICC 患者和 7 例 CHC 患者（圖1a），共得到 1,092,172 個細胞數(shù)據(jù)，分為 89 個細胞群（圖1b, c）。得益于大型隊列和非富集策略，數(shù)據(jù)得到了多種細胞類型和大量中性粒信息。數(shù)據(jù)中腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）細胞具有顯著的組織和腫瘤亞型特異性。拷貝數(shù)分析顯示大部分上皮細胞是腫瘤細胞，并且具有患者異質性。該圖譜數(shù)據(jù)還整合了隊列臨床信息和基因組信息，有利于肝癌細胞異質性的綜合分析和細節(jié)研究。

2、揭示肝癌五種免疫微環(huán)境亞型（TIMELASER）

研究人員根據(jù)細胞群共富集模式將 TIME 細胞類型聚類成 5 個細胞群模塊（CM1-CM5）（圖2a）。根據(jù)這些模塊在隊列中的富集差異，結合細胞群、功能標記基因表達、TIME 相關基因特征和預后相關性，將患者分成 5 種 TIME 亞型（圖2b, c）。

其中，CM1 包括活性髓系和 T 細胞群，富集 CM1 的患者具有免疫激活狀態(tài)，因此定義為免疫激活型 TIME（TIME-IA）；CM2 富集 Mph_03_SPP1 群并高表達 IL1B，具有髓系免疫抑制特性和促癌趨化因子，且與臨床預后差正相關，CM2 富集的患者被定義為髓系免疫抑制型 TIME（TIME-ISM）；CM3 和 CM4 均含有基質細胞，其中 CM3 高表達腫瘤激活基因，富集胞外基質和腫瘤相關成纖維細胞（CAF）特征，與預后差正相關，CM3 患者可以定義為基質免疫抑制型（TIME-ISS）；CM4 含有內皮和間充質細胞群，缺少免疫細胞，具有排斥 T 細胞的 CXCL12+?成纖維細胞，GZMK+?CD8+?T 細胞也在該模塊富集但多色免疫組化（mIHC）顯示毒性 T 細胞被隔離在腫瘤區(qū)域外（圖2f），因此 CM4 富集的患者被定義為免疫排斥型 TIME（TIME-IE）；CM5 含有肝駐留細胞群，包括駐留 NK 細胞群、枯否細胞和肝竇內皮細胞，與預后較好正相關，所以 CM5 富集患者被定義為免疫駐留型 TIME（TIME-IR）。
作者將該分類命名為 TIMELASER（圖2d），生存分析顯示該分型與臨床預后結果一致（圖2e），說明了這種分型方法的可靠性和臨床相關性。作者還用已發(fā)表的單細胞和批量 RNA 測序結果進行了驗證。
另外，作者還發(fā)現(xiàn) TIMELASER 亞型間具有不同的趨化因子和細胞因子表達模式（圖2g, h）。例如?CXCL9/10/11-CXCR3?在 TIME-IA 中富集，CXCL1/3/8-CXCR2?在 TIME-ISM 中富集。外顯子組數(shù)據(jù)顯示 TIMELASER 亞型間還具有腫瘤細胞的驅動基因突變差異。這些分析說明?TIMELASER 分型不僅表征了患者間的 TIME 差異，還體現(xiàn)了深層次的趨化因子網絡和腫瘤體細胞變異差異。

3、肝癌中的中性粒異質性及功能

研究得到了共 34,307 個中性粒細胞，分為 11 個亞群，具有明顯的組織和腫瘤類型特異性（圖3a）。Neu_02_S100A12、Neu_03_ISG15 和 Neu_04_TXNIP 是外周血中性粒（PBNs），Neu_05_ELL2 和 Neu_06_PTGS2 是癌旁中性粒（ALNs），另外 6 類富集于腫瘤組織，定義為腫瘤相關中性粒（TANs）（圖3b）。擬時序分析揭示了從 PBNs 到 ALNs 再到 TANs 的分化軌跡（圖3a）。調節(jié)子分析顯示不同來源的中性粒表達不同的轉錄因子（圖3c），ATAC 結果驗證了這些轉錄因子的特異性活化。這些結果說明了肝癌中中性粒的分化是由不同的轉錄因子進行時空特異性調節(jié)的。

作者接下來著重研究 Neu_11_CCL4 和 Neu_09_IFIT1 兩種中性粒亞群。CCL4+?TANs 高表達?CCL3?和?CCL4（圖3d），病人來源 TANs 相對于非 TANs 具有更高的?CCL4基因活化和 CCL4 蛋白水平（圖3f,g）。趨化實驗顯示 TANs 共培養(yǎng)可以招募單核細胞（圖3h）。通過體外 PBNs 與肝癌細胞系的共培養(yǎng)，他們誘導出了類似于 Neu_11_CCL4 亞群的“體外TANs”（圖3e）。這些結論說明了?TANs 的趨化因子分泌功能和 CCL4+?TANs 對巨噬細胞的招募作用。

TANs 中還高表達?CD274（編碼PD-L1）（圖3i），“體外 TANs”也表達?CD274?并且表達量隨時間升高（圖3j），流式分選確定“體外 TANs”高表達 PD-L1 蛋白（圖3k）。ATAC 和流式分選均表明病人來源 TANs 也具有?CD274?活化和 PD-L1 表達的特性（圖3l, m）。體外 TANs 和病人來源 TANs 與 CD8+?T 細胞的共培養(yǎng)都顯示 TANs 可以通過高表達 PD-L1 抑制 T 細胞活性（圖3n-p）。另外 mIHC 展示了 PD-L1+?中性粒和 PD1+?CD8+?T 細胞的臨近位置關系（圖3q）。這些實驗表明肝癌中的 PD-L1+?TANs 可以抑制毒性 CD8+?T?細胞活性。

4、小鼠肝癌模型揭示中性粒的亞群保守性及功能

為了進一步研究 TANs 的體內的功能異質性，研究人員構建了兩種基于?Alb-cre/Trp53fl/fl?肝臟特異敲除小鼠和肝癌驅動突變的小鼠肝癌模型（Myc-?90Ctnnb1，pTMC；Myc-KrasG12D，pTMK）。作者取 6 只小鼠的外周血、癌旁和腫瘤共 21 份樣本進行單細胞轉錄組測序，得到 17,780 個中性粒細胞，分為 12 個細胞群，這些細胞群具有組織特異性和明顯的發(fā)育軌跡（圖4a, b）。中性粒亞群間一致的特征基因表達模式說明了其保守性（圖4c）。人肝癌患者的 TIME-ISM TANs (Neu_09/10/11) 分別對應小鼠中性粒亞群 mNeu_10/11/12，而且小鼠 TANs 也高表達?Cd274（圖4d），這些結果證明了中性粒亞群的保守性，為后續(xù)在小鼠肝癌模型進行中性粒靶向治療建立了基礎。

研究人員通過 anti-Ly6G 抗體去除模型小鼠體內的中性粒，中性粒去除后小鼠腫瘤明顯縮?。▓D4e, f），TANs 數(shù)量和 PD-L1 表達均降低（圖4g），免疫組化驗證了中性粒和增殖惡性細胞的減少（圖4h）。結果還顯示約 70%的中性粒被去除，浸潤性巨噬細胞減少 46.6%，CD8+?T 恢復活性（免疫檢查點標記 PD-1 和 TIM3 降低）（圖4g）。熒光報告基因實驗驗證了腫瘤的縮減（圖4i, j）。對兩只 anti-Ly6G 治療小鼠的骨髓、外周血、癌旁組織和腫瘤的單細胞測序顯示，大部分 TANs 被去除，但 mNeu_09_Apoa2 亞群增多，該群對應人肝癌的 Neu_07_APOA2 亞群與良性預后正相關，這類 TANs 高表達脂質代謝特征，可能屬于脂質相關中性粒?？傊?，小鼠模型中的中性粒去除能夠改變 TANs 組分，有效削弱腫瘤進展。

總結

文章通過分析來源于肝癌和小鼠模型的 130 萬個單細胞轉錄組數(shù)據(jù)，構建了一套全新的肝癌的免疫微環(huán)境分型體系：TIMELASER，對于該分型體系的深入分析有助于我們對腫瘤-微環(huán)境和微環(huán)境-微環(huán)境互相作用的理解，輔助發(fā)現(xiàn)新的生物標志物和免疫治療靶標。另一方面，文章揭示了肝癌中性粒的異質性，明確表明大部分腫瘤相關中性粒的促癌作用，并在小鼠模型中驗證了去除中性粒可以有效抑制腫瘤進展，為新的肝癌免疫治療靶標提供了線索。

作者介紹 //

北京大學第一醫(yī)院薛瑞棟副研究員、北京大學 BIOPIC 張啟明博士、北京大學第一醫(yī)院博士研究生曹奇、北京大學第一醫(yī)院孔瑞瑞副研究員和北京大學人民醫(yī)院向驍博士是該論文的并列第一作者。北京大學第一醫(yī)院腫瘤轉化中心張寧教授、北京大學 BIOPIC 張澤民教授和北京大學人民醫(yī)院朱繼業(yè)教授為共同通訊作者。

參考文獻：

Xue R, Zhang Q, Cao Q, Kong R, Xiang X, Liu H, Feng M, Wang F, Cheng J, Li Z, Zhan Q, Deng M, Zhu J, Zhang Z, Zhang N. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity.?Nature. 2022 Nov 9. doi: 10.1038/s41586-022-05400-x. Epub ahead of print. PMID: 36352227.