熒光定量PCR技術(shù)分享（技術(shù)簡(jiǎn)介，技術(shù)原理，常見(jiàn)儀器機(jī)型，實(shí)驗(yàn)步驟及引物設(shè)計(jì)）
?大家好啊，今天要給大家分享的是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中另一項(xiàng)常用的技術(shù)：熒光定量PCR（Real-time PCR）。我們都知道蛋白質(zhì)是生命功能的承擔(dān)者，而Western?blotting技術(shù)是測(cè)試蛋白表達(dá)的一項(xiàng)基本技術(shù)。但是呢通過(guò)中心法則（DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄再到翻譯）我們可以知道，基因的表達(dá)決定蛋白質(zhì)的表達(dá)，而Real-time PCR是檢測(cè)基因表達(dá)的常用方法。在這里，我將從Real-time PCR的技術(shù)簡(jiǎn)介，技術(shù)原理，常見(jiàn)儀器機(jī)型，實(shí)驗(yàn)步驟及引物設(shè)計(jì)等幾個(gè)方面對(duì)Real-time PCR技術(shù)進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單介紹。
1.Real-time PCR簡(jiǎn)介
????????1992年，日本人Higuchi最早提出了“實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)”（Real-time PCR）。1996年，美國(guó)生物公司推出全球首臺(tái)熒光定量PCR儀，由PCR擴(kuò)增熱循環(huán)系統(tǒng)、熒光檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)及應(yīng)用軟件組成。通過(guò)熒光染料或熒光探針，對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；通過(guò)數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，結(jié)合軟件進(jìn)行結(jié)果分析，實(shí)現(xiàn)計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量的計(jì)算。由此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。
????????Real-time PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-time PCR通過(guò)在PCR擴(kuò)增體系中摻入熒光染料，檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的產(chǎn)生熒光信號(hào)，可以對(duì)PCR的擴(kuò)增進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。且由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。
????????Real-time PCR主要由定量PCR儀，八聯(lián)管，試劑及PC分析端等幾部分組成。
2.Real-time PCR原理
????????Real-time PCR的原理依據(jù)測(cè)試方法不同存在區(qū)別。Real-time PCR主要包括熒光標(biāo)記法及熒光探針?lè)?。熒光?biāo)記法指以SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法；熒光探針?lè)ㄖ敢?/span>Taqman探針?lè)橹鞯拇銣缛玖弦锓ā?/span>
2.1 SYBR Green I染料法原理
????????SYBR Green I是一種高靈敏度的非特異性雙鏈DNA熒光染料，具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)。DNA發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，SYBR Green I可以非特異性的結(jié)合在dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域。
??游離的SYBR Green I只發(fā)出極弱的熒光信號(hào)，而嵌合在擴(kuò)增產(chǎn)物（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域中的SYBR Green I會(huì)發(fā)出強(qiáng)熒光，熒光信號(hào)被千倍放大，且在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系。因此，可以通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度從而檢測(cè)初始dsDNA的濃度。
????????SYBR Green I染料法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本較低，被廣泛地應(yīng)用于DNA及RNA定量、基因表達(dá)量的研究、轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究等，但是因?yàn)镾YBR Green I與dsDNA雙螺旋的結(jié)合是非特異性的。所以SYBR Green I與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物（目標(biāo)dsDNA）結(jié)合的同時(shí)還可以同引物二聚體及非特異性擴(kuò)增的dsDNA結(jié)合，可能影響結(jié)果判斷。所以擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，還必須對(duì)生成的dsDNA進(jìn)行分析：即通過(guò)升溫使dsDNA雙鏈解開(kāi)，SYBR Green I染料脫落，熒光值逐漸下降，形成溫度和熒光強(qiáng)度的曲線(xiàn)：即“熔解曲線(xiàn)（Melting curve）”。依據(jù)溶解曲線(xiàn)是否為單峰來(lái)判斷擴(kuò)增體系中是否存在引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增（注：因?yàn)椴煌臄U(kuò)增產(chǎn)物的Tm值存在差異，所以如果產(chǎn)物中存在非特異性擴(kuò)增，則會(huì)出現(xiàn)多峰現(xiàn)象）。
2.1?Taqman探針?lè)?/strong>
Taqman探針是由5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)以及與目標(biāo)基因特異性結(jié)合的寡核苷酸序列組成。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，此時(shí)儀器不會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。在PCR擴(kuò)增時(shí)，模板DNA變性解鏈，Taqman探針特異性結(jié)合到目標(biāo)基因處，而Taq酶具有5’-3’核酸外切酶活性，延伸至探針結(jié)合處，可將探針?biāo)?，使熒光?bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而檢測(cè)到熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。熒光信號(hào)被儀器檢測(cè)并采集得到“擴(kuò)增曲線(xiàn)”，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度反映出體系中dsDNA的濃度。
??筆者一般使用的是SYBR Green I染料法，對(duì)Taqman探針不是特別了解?？偨Y(jié)Taqman探針?lè)ǖ脑頌椋篢aqman探針?lè)ǖ臄U(kuò)增試劑中包含有5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針（與單鏈DNA結(jié)合）以及能與目標(biāo)基因特異性結(jié)合的含Taq酶（具備5’-3’外切酶活性）的寡核苷酸序列。只有發(fā)生特異性擴(kuò)增時(shí)，Taq酶才會(huì)剪切寡核苷酸探針，將熒光報(bào)告基團(tuán)剪切脫落。從而激發(fā)熒光。
參考文章鏈接：
1.https://zhuanlan.zhihu.com/p/565126750
2.https://baike.baidu.com/item/%E5%AE%9E%E6%97%B6%E8%8D%A7%E5%85%89%E5%AE%9A%E9%87%8FPCR/5395897
3 Real-time PCR機(jī)型
??為什么要介紹Real-time PCR的機(jī)型呢？因?yàn)镽eal-time PCR的上機(jī)不同于WB的曝光（WB的曝光可能因?yàn)闄C(jī)型的原因，在程序操作上存在區(qū)別，但是只要你有條帶和顯影液，基本上都是能曝光出來(lái)的）。
??但是Real-time PCR的上機(jī)卻因?yàn)闄C(jī)型的不同存在很大的區(qū)別（不要問(wèn)我為什么知道，當(dāng)你騎個(gè)電動(dòng)車(chē)，拿著配好的模板，逛了三四個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)都無(wú)法上機(jī)時(shí)，你就這輩子都不會(huì)忘記Real-time PCR上機(jī)存在機(jī)型不同了（手動(dòng)苦澀））。
??首先，不同的機(jī)型使用的八聯(lián)管不一樣，就筆者所了解的八聯(lián)管就分為高管、低管及96孔的套管等等。強(qiáng)行使用與機(jī)型不匹配的八聯(lián)管上機(jī)不僅無(wú)法得到正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而且會(huì)損壞儀器（注意：很大概率損壞，因?yàn)?/span>PCR擴(kuò)增溫度的控制是通過(guò)儀器與八聯(lián)管接觸的熱蓋來(lái)進(jìn)行控制的。如果使用與機(jī)型不匹配的八聯(lián)管進(jìn)行上機(jī)時(shí)；eg：高管儀器上低管八聯(lián)管，儀器熱蓋與八聯(lián)管不接觸，無(wú)法進(jìn)行PCR擴(kuò)增；低管儀器上高管八聯(lián)管，擠壓PCR儀熱蓋，造成儀器損壞）。
其次，Real-time PCR的試劑中有一個(gè)叫Rox的試劑，它是儀器的矯正染料，可以矯正孔板及試劑蒸發(fā)產(chǎn)生的誤差等（這里必須注意的是：不同機(jī)型的Rox的種類(lèi)不同，就我所知的諾唯贊和Takela的試劑中就分Rox I和Rox II）。
儀器介紹鏈接：https://www.docin.com/p-2348809832.html
4.實(shí)驗(yàn)步驟
????????Real-time PCR的實(shí)驗(yàn)步驟并不是非常復(fù)雜，主要包括RNA提取—反轉(zhuǎn)錄—體系配制—上機(jī)及結(jié)果分析等幾個(gè)步驟（以后有機(jī)會(huì)的話(huà)再跟大家介紹）。
5.引物設(shè)計(jì)
最后，給大家介紹一下Real-time PCR的引物介紹：
5.1搜索NCBI
5.2選擇Gene，輸入需要合成引物的名字及種屬
5.3選擇對(duì)應(yīng)種屬的基因選項(xiàng)
5.4進(jìn)入后下翻至accession number號(hào)
5.5進(jìn)入后選擇Pick Primers
5.6進(jìn)入后選擇擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，及是否跨外顯子
5.7點(diǎn)擊Get primers，等待一會(huì)兒后可以得到相應(yīng)的引物
選擇引物時(shí)：遵循下述原則（見(jiàn)鏈接）
https://www.biomart.cn/specials/4abio/article/528822
本文作者：LGN審核：豬豬
聲明：作者水平有限，只代表個(gè)人觀點(diǎn)。如有建議，可在評(píng)論區(qū)共同進(jìn)行相關(guān)討論。
???????本文主要分享了一些有關(guān)Real-time PCR的基礎(chǔ)的知識(shí)。作者能力有限，一些更深層次的內(nèi)容歡迎大家在討論區(qū)補(bǔ)充，也歡迎有相關(guān)研究方向的學(xué)者一起討論交流，謝謝大家！
PS：歡迎大家關(guān)注“生物分析課題組”公眾號(hào)，一起探討科學(xué)相關(guān)問(wèn)題。
