小核酸藥物簡介及機理

小核酸藥物又稱RNAi（RNA interference）技術藥物。所謂RNAi，是指長鏈雙RNA（dsRNA）被剪切為siRNA（小干擾RNA）后，與蛋白質結合形成siRNA誘導干擾復合體（RISC），RISC再與互補的mRNA（信使RNA）結合，使靶基因mRNA降解，最終沉默特定基因表達。

狹義的小核酸是指介導RNAi的短雙鏈RNA片斷，即siRNA；廣義的小核酸范圍則涵蓋了siRNA、miRNA（微小RNA）和反義核酸（ASO）等。

代表性的作用機制和細胞內(nèi)定位(1)gapmer和mRNA降解, (2)適配體, (3)核空間阻滯剪接開關, (4)阻斷RNA結合因子的組裝, (5) TLR激活先天免疫，(6) miRNA和Antagomir，空間阻滯，翻譯上調(diào)，(7) Agomir，翻譯抑制，(8)siRNA、RISC, RNAi沉默ONs。

RNAi技術研究于2006年獲得諾貝爾獎，堪稱人類科學史上的重大發(fā)現(xiàn)和技術革新。目前已有16款小核酸藥物上市，包括10款ASO，5款siRNA，1款aptamer。多款小核酸藥物的開花結果以及商業(yè)化，引燃了國內(nèi)外眾多藥企的研發(fā)熱情。小核酸藥物因設計和開發(fā)不受限于蛋白質的可成藥性及靶點的發(fā)現(xiàn)，被寄希望成為“第三次制藥浪潮”。

小核酸藥物主要特點與優(yōu)勢

作用靶點豐富

不受靶點成藥性限制，理論上各種由特定基因過表達引起的疾病都可以通過小核酸藥物進行治療，并且可以及時響應靶基因的突變以進行調(diào)整；

設計開發(fā)簡單

小核酸藥物直接針對靶基因mRNA序列進行設計，僅需知道堿基序列即可進行，從而避免了傳統(tǒng)藥物開發(fā)中的大規(guī)模設計、優(yōu)化、篩選周期，藥物設計得以主動進行，研發(fā)成功率得以提高；

靶向特異性強

小核酸藥物作用于靶基因轉錄的mRNA，在疾病上游進行調(diào)控，并且可以達到單堿基水平上的序列特異性，具有“有的放矢”及“治標治本”的特點。隨著遞送系統(tǒng)的不斷更新，藥物靶向性不斷優(yōu)化；

藥物作用長效

小核酸藥物以mRNA為目標，在體內(nèi)可以通過多次循環(huán)工作持續(xù)起效。此外，核酸藥物的化學修飾技術不斷革新，可提高核酸藥物的穩(wěn)定性和半衰期，使藥物作用更長效，大大提高患者治療的依從性。

圖3 小核酸藥物化學修飾

小核酸藥物合成過程

經(jīng)過不斷地探索，上世紀80年代，已經(jīng)實現(xiàn)了小核酸藥物（寡核酸藥物）的自動化合成和商品化。寡核苷酸的基本組成單位是亞磷酰胺單體，它的合成是一個多步連續(xù)的反應，常用的合成方法是固相亞磷酰胺三酯法，其具體過程包括四個循環(huán)步驟：去保護、偶聯(lián)、氧化、加帽，合成路線如圖所示：

01去保護<<<<? ??

用三氯乙酸(TCA)脫去連接在固相載體CPG上的核苷酸保護基團DMT，從而產(chǎn)生5'-OH活性基團，使得接下來的偶聯(lián)得以進行；

02偶聯(lián)<<<<? ? ? ?

下一個核酸的亞磷酰胺單體與四唑反應生成活性中間體（此步驟也被稱為活化）。去保護中形成的5'-OH會與活性中間體結合，形成新的磷氧鍵，并脫去四唑，核苷酸鏈得到延伸；

03氧化/硫化<<<<

偶聯(lián)反應生成的亞磷酯鍵，易被酸、堿水解，因此需將此處三價磷氧化（硫化）為五價的磷；

04加帽<<<<? ? ? ??

為了防止CPG上未參與反應的5'-羥基在隨后的循環(huán)反應中被延伸，常用乙?；噭﹣矸忾]此端羥基，形成?；?，防止非目標寡核苷酸產(chǎn)物的形成。

當寡核苷酸鏈經(jīng)過多次循環(huán)達到所需的長度時，將合成好的寡核苷酸鏈從固相載體上切割下來，通常使用濃氨水將固體載體與初始核苷之間的酯鍵斷裂，之后通過延長時間處理或加熱，脫去磷酸二酯鍵上的2-氰乙基保護和堿基上的保護基團。RNA鏈則需要額外使用TBAF（氟化物）對 2’位羥基上的TBDMS脫保護，之后，對樣品進行脫鹽以及純化，最終獲得合格的寡核苷酸。

從以上固相合成過程中可知，亞磷酰胺單體是寡核苷酸合成中的核心原料，因此，符合質量要求的亞磷酰胺單體及時供應是小核酸藥物商業(yè)化的關鍵因素。

目前，已有很多針對高血脂、高血壓、非酒精性肝炎、乙肝等適應癥的小核酸藥物正在進行晚期臨床研究，包括許多針對罕見病的小核酸產(chǎn)品在國外未來也會陸續(xù)上市，此為市場快速增長的關鍵驅動因素。為了更好的助力核酸藥物研發(fā)以及商業(yè)化，申基生物可提供小核酸藥物合成過程中所需的各類核苷、亞磷酰胺單體（DNA、RNA、2'-O-Me、2'-O-MOE、2'-Fluoro、2'-O-Propargyl等修飾單體）以及寡核苷酸合成服務，從而滿足各類核酸藥物研發(fā)企業(yè)及生產(chǎn)企業(yè)的不同需求，為全球核酸藥物發(fā)展“添磚加瓦”！