了解卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制對(duì)于生殖生物學(xué)和醫(yī)學(xué)來(lái)說(shuō)是必不可少的。從生發(fā)囊泡(GV)階段開始直到早期胚胎的合子激活，卵母細(xì)胞降低其全基因組轉(zhuǎn)錄活性，依靠翻譯調(diào)控來(lái)控制基因表達(dá)。近年來(lái)的單細(xì)胞多組學(xué)和干細(xì)胞體外分化研究為揭示人類卵母細(xì)胞基因表達(dá)開辟了新的途徑。然而，受限于目前質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的局限性，這些研究主要集中在基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并不能真實(shí)地反應(yīng)卵子成熟過程中的翻譯表達(dá)水平或蛋白表達(dá)水平。

2022年8月30，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院紀(jì)家葵課題組、中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心梁曉燕課題組及國(guó)內(nèi)多家生殖中心團(tuán)隊(duì)合作，以“Single-cell transcriptome and translatome dual-omics reveals potential mechanisms of human oocyte maturation”為題在線發(fā)表于Nature communications，該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出的適用于單個(gè)卵母細(xì)胞且不需要任何純化標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄-翻譯雙組學(xué)測(cè)序技術(shù)(T&T-seq)，可同時(shí)檢測(cè)單個(gè)卵母細(xì)胞樣本中的總mRNA及正在翻譯的mRNA，并以此揭示了小鼠和人卵母細(xì)胞之間不同的翻譯表達(dá)模式，描述了人類卵母細(xì)胞成熟過程中從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的序列基因表達(dá)調(diào)控。此外，該研究發(fā)現(xiàn)OOSP2分泌蛋白對(duì)卵子的體外成熟具有促進(jìn)作用，為臨床輔助生殖技術(shù)提供新的技術(shù)手段。

研究材料

人GV卵母細(xì)胞、MII卵母細(xì)胞、桑葚胚；小鼠GV卵母細(xì)胞、MII卵母細(xì)胞

技術(shù)路線

1、 描繪人類卵母細(xì)胞成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組和翻譯組圖譜；

2、 探究高翻譯的基因共有的翻譯調(diào)節(jié)元件；

3、 探究人類與小鼠卵母細(xì)胞的獨(dú)特翻譯基因；

4、 探究OOSP2蛋白對(duì)卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控作用；

主要研究結(jié)果

1、 描繪人類卵母細(xì)胞成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組和翻譯組圖譜

研究人員通過T&T-seq對(duì)10個(gè)、單個(gè)人卵母細(xì)胞及桑葚胚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共得到11756個(gè)GV和10559個(gè)MII翻譯基因，并將獲得的翻譯組學(xué)數(shù)據(jù)與先前文獻(xiàn)報(bào)道中使用100個(gè)人類GV或MII卵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示超過86%的GV蛋白和83%的MII蛋白被檢測(cè)到（圖2a）。此外，作者對(duì)轉(zhuǎn)錄組和翻譯組的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組的 PCA 中GV和MII卵母細(xì)胞有部分重疊，而相同樣本的翻譯組PCA結(jié)果明顯地分離了 GV 卵母細(xì)胞、MII 卵母細(xì)胞和胚胎，這表明翻譯組要比轉(zhuǎn)錄組更能夠表現(xiàn)GV和MII卵母細(xì)胞之間的差異（圖2b）。進(jìn)一步地，研究者在轉(zhuǎn)錄組和翻譯組水平上分析了GV和MII卵母細(xì)胞中的差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示在卵母細(xì)胞成熟過程中，大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄水平保持不變或降低。此外，在成熟的卵母細(xì)胞中，基因的翻譯效率要高于未成熟的卵子。值得注意的是，大多數(shù)GV富集的基因參與細(xì)胞質(zhì)過程，而MII富集的基因主要參與細(xì)胞核或染色體過程（圖2 h-j），這一結(jié)果揭示了卵母細(xì)胞成熟過程中基因表達(dá)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的順序調(diào)節(jié)。

2. 探究高翻譯的基因共有的翻譯調(diào)節(jié)元件

先前對(duì)小鼠的研究表明，卵母細(xì)胞成熟過程中的高翻譯表達(dá)是由RNA結(jié)合蛋白（RBP）與3'UTR結(jié)合的翻譯調(diào)節(jié)元件所調(diào)節(jié)。然而，由于缺乏翻譯組數(shù)據(jù)集，目前尚未報(bào)道人類卵母細(xì)胞中的RBP基序。因此，研究者篩選了人類GV和MII卵母細(xì)胞中高翻譯效率[ TE（>1）] 基因的3' UTR，以確定潛在的RBP位點(diǎn)，并研究RBP作為潛在的翻譯調(diào)控因子。研究人員篩選出了高TE MII基因中的RBP結(jié)合基序，分別為FXR1、PCBP1、DDX3X、CPEB2和CPEB4 的結(jié)合基序。此外，研究者鑒定出與卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的GO聚類中的高 TE基因，例如“染色體分離”、“減數(shù)分裂細(xì)胞周期”和“甲基化”等。

3、?探究人類與小鼠卵母細(xì)胞的獨(dú)特翻譯基因

小鼠模型常被用于研究和推斷人類卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制，然而，人類卵母細(xì)胞可能存在獨(dú)特的翻譯表達(dá)和調(diào)控。因此，基于小鼠和人類卵母細(xì)胞的T&T-seq，研究者通過選擇人類卵母細(xì)胞中翻譯水平較高但在小鼠卵母細(xì)胞中翻譯相對(duì)較低的DEGs，分析了獨(dú)特的人類DEGs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了247個(gè)GV特異性基因和259個(gè)MII特異性基因，在這些獨(dú)特的人類MII基因中，DNMT1、MSH3、CENPK、OOSP2和AGO2在人類和小鼠中的翻譯表達(dá)趨勢(shì)相反(圖4f)。值得注意的是，在小鼠OOSP家族中，OOSP1和OOSP3蛋白都是在成熟過程中表達(dá)上調(diào)的，而OOSP2蛋白是在成熟過程中表達(dá)下調(diào)。然而在人的OOSP家族中卻正好相反。研究者發(fā)現(xiàn)小鼠OOSP2基因只有一個(gè)PAS基序，而OOSP1和OOSP3均有多個(gè)與PAS基序相鄰的CPE基序。相比之下，人類OOSP2是唯一同時(shí)攜帶CPE和PAS的OOSP基因（圖4）。

4、OOSP2蛋白誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟

PPI分析顯示，OOSP2可能參與卵泡產(chǎn)生及卵母細(xì)胞成熟。為了探究OOSP2是否對(duì)卵子的成熟具有調(diào)控作用，研究者收集了GV卵母細(xì)胞，并使用帶有延時(shí)顯微鏡的孵化器來(lái)監(jiān)測(cè)卵母細(xì)胞的成熟。結(jié)果表明，添加OOSP2蛋白可以提高人卵母細(xì)胞體外成熟率，而添加OOSP2的抗體則會(huì)阻斷OOSP2蛋白的功能，從而影響卵母細(xì)胞的成熟（圖5）。此外，研究者進(jìn)一步探究了OOSP2的潛在誘導(dǎo)基因或途徑。通過檢測(cè)與hReco-OOSP2、α-OOSP2或無(wú)任何添加劑共孵育1.5 h的人類GV卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和翻譯組，結(jié)果表明α-OOSP2處理的GV卵母細(xì)胞保持不成熟狀態(tài)，而hReco-OOSP2處理的GV卵母細(xì)胞更接近于成熟卵子。另外，OOSP2可以直接調(diào)控下游基因的翻譯，并通過上調(diào)特定的信號(hào)通路，如小GTPase信號(hào)通路、細(xì)胞器定位通路等，來(lái)促進(jìn)卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟（圖6）。

小結(jié)：

研究者通過適用于單個(gè)卵母細(xì)胞的T&T-seq技術(shù)，揭示了人卵母細(xì)胞成熟過程中從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的時(shí)空順序調(diào)節(jié); 發(fā)現(xiàn)了小鼠和人類的卵母細(xì)胞在成熟過程中翻譯的差異化；鑒定出OOSP2分泌蛋白可能通過調(diào)控小GTPase信號(hào)通路相關(guān)蛋白的翻譯來(lái)促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，為臨床卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)提供了新的技術(shù)方法及理論依據(jù)。

文章中所用的是單細(xì)胞翻譯組，而中科新生命自建立單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)以來(lái)，已經(jīng)在檢測(cè)數(shù)量，檢測(cè)深度上實(shí)現(xiàn)重大突破。針對(duì)卵母細(xì)胞、受精卵、胚胎等生殖領(lǐng)域樣本，中科新生命已可在單個(gè)細(xì)胞層面實(shí)現(xiàn)高深度的蛋白鑒定，如單個(gè)小鼠卵母細(xì)胞平均2800+蛋白鑒定數(shù)，單個(gè)人卵母細(xì)胞平均4000+蛋白鑒定數(shù)。