前言

2021年10月，廣東石油化工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院孫建騰教授課題組在《Chemosphere》期刊發(fā)表的題為“Metabolomic analysis and oxidative stress response reveals the toxicity in Escherichia coli induced by organophosphate flame retardants tris (2-chloroethyl) phosphate and triphenyl phosphate”的研究成果，通過GC-MS非靶向代謝組學(xué)等研究方法，發(fā)現(xiàn)包括糖酵解/糖異生、磷酸戊糖代謝、嘌呤代謝、谷胱甘肽代謝、胺素代謝，丙氨酸和天冬氨酸等代謝途徑被破壞。大多數(shù)差異表達(dá)的代謝物被下調(diào)，表明有機(jī)磷阻燃劑對(duì)代謝功能和關(guān)鍵代謝途徑有抑制作用。本研究揭示了生物中有機(jī)磷阻燃劑對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)提供了新的見解。

基本信息

中文標(biāo)題：代謝組學(xué)分析和氧化應(yīng)激反應(yīng)揭示了有機(jī)磷類阻燃劑磷酸三(2-氯乙基)和磷酸三苯基對(duì)大腸桿菌的毒性

研究對(duì)象：大腸桿菌

發(fā)表期刊：Chemosphere

影響因子：7.086

作者單位：廣東石油化工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院

涉及的歐易/鹿明生物服務(wù)產(chǎn)品：GC-MS非靶向代謝組學(xué)(由歐易/鹿明生物提供技術(shù)支持)

研究背景

有機(jī)磷阻燃劑(OPFRs)是一種新興的環(huán)境污染物，磷酸三苯基(TCEP)和磷酸三苯基(TPHP)對(duì)動(dòng)植物的不利影響已成為日益受到關(guān)注的問題。但生物體中OPFRs分子水平的毒性機(jī)制仍然缺乏。為此，將大腸桿菌(E.coli)暴露于TCEP和TPHP中24和48h，以揭示氧化應(yīng)激反應(yīng)和分子毒性機(jī)制。

研究思路

研究結(jié)果

TCEP和TPHP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧生成

ROS作為有氧呼吸中負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡的氧化還原信使，在調(diào)節(jié)信號(hào)通路和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。強(qiáng)氧化應(yīng)激破壞了細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和氧化分解之間的平衡，氧化應(yīng)激導(dǎo)致膜損傷、特定蛋白功能障礙和生化過程的代謝紊亂。ROS水平的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。暴露于TCEP和TPHP 24小時(shí)后，大腸桿菌中的ROS略有升高，而隨著暴露時(shí)間延長到48小時(shí)，ROS水平有所升高。此外，在TCEP和TPHP暴露24和48h后，ROS水平以顯著的時(shí)間-劑量方式升高(p<0.05)。

為了進(jìn)一步證實(shí)ROS在TCEP和TPHP誘導(dǎo)的大腸桿菌氧化應(yīng)激中作為敏感的啟動(dòng)劑，在大腸桿菌中暴露24小時(shí)后細(xì)胞活力略有增加，直到48h時(shí)細(xì)胞活力顯著增加，證明NAC預(yù)處理在一定程度上消除了ROS的積累。

圖1| TCEP和TPHP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞活力發(fā)生變化

由TCEP和TPHP引起的SOD和CAT活性的變化

在指定劑量的TCEP和TPHP處理下，大腸桿菌中SOD和CAT活性的變化見圖2。在低劑量的TCEP和TPHP(10μM)處理24h后，SOD和CAT活動(dòng)輕微被抑制，而在更高劑量的治療組48h(25和50μM)處理后顯著被抑制。大腸桿菌對(duì)TCEP和TPHP脅迫下SOD和CAT活性的變化基本相同，表明這兩種酶對(duì)抗氧化應(yīng)激存在協(xié)同作用。從這個(gè)意義上說，作者推斷SOD首先被觸發(fā)分解O，同時(shí)促進(jìn)CAT活性將過氧化氫分解為水和O。在之前發(fā)表的研究中，短短芽孢桿菌暴露于TPHP后的SOD和CAT活性均增加，表明這些抗氧化酶可能削弱TPHP誘導(dǎo)的抑制作用。

圖2| TCEP和TPHP對(duì)不同水平TCEP和TPHP處理的大腸桿菌SOD和CAT活性水平的影響

TCEP和TPHP誘導(dǎo)的MDA含量的改變

MDA是脂質(zhì)過氧化的主要成分，從圖3所示的MDA結(jié)果來看，其基本趨勢(shì)與SOD和CAT結(jié)果相似，不同劑量TCEP和TPHP處理24h后MDA含量略有升高，但在高劑量TCEP和TPHP處理48h后明顯上升。如圖3b所示，在10、25、50μM作用48h后，MDA含量分別升高了53.7%、71.1%、84.8%、60.9%、85.0%和88.3%(p<0.05)。在相同的暴露條件下，TPHP誘導(dǎo)的MDA水平的升高比仍高于TCEP，這與ROS的結(jié)果吻合較好。

圖3| 不同濃度的TCEP和TPHP處理后的大腸桿菌中MDA水平

TCEP和TPHP誘導(dǎo)的MDA含量的改變

程序性細(xì)胞死亡(PCD)的過程是細(xì)胞凋亡，其特征是DNA碎片化和膜去極化，被解釋為外源性物質(zhì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的另一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。采用AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡和完整的細(xì)胞膜，或晚期凋亡（或壞死）導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性的喪失。凋亡的變化趨勢(shì)和活細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡細(xì)胞四種細(xì)胞分布分別如圖4a和b所示。暴露24和48h后，TCEP和TPHP可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量和時(shí)間依賴性。

圖4| TCEP和TPHP暴露對(duì)大腸桿菌細(xì)胞凋亡的影響

TCEP和TPHP脅迫對(duì)大腸桿菌atp酶活性的影響

Na/KATPase(NKA)是一種跨膜酶，負(fù)責(zé)將Na和K離子跨細(xì)胞膜運(yùn)輸，在滲透調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，被廣泛用作有毒環(huán)境中細(xì)胞活性的生物指標(biāo)。NKA受體，被認(rèn)為是一個(gè)離子泵，不僅維持細(xì)胞膜電位，細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞體積和鈣濃度也參與各種蛋白質(zhì)相互作用，激活蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)和參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如Ca信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧生成。

我們測(cè)定了Na/KATPase(Na泵)和Ca/MgATPase(Ca泵)的活性，兩種酶活性均呈劑量和時(shí)間依賴性的下降趨勢(shì)。TCEP和TPHP在10、25和50μM處理24h后，其活性有輕微抑制。Na泵和Ca泵水平下降，14.9–33.7%和20.1–32.4%。然而，如圖5b和d所示，在較高劑量的TCEP和TPHP作用48h后，Na/KATP酶和Ca/MgATP酶的活性顯著升高。

圖5| TCEP和TPHP暴露下大腸桿菌Na/KATP酶和Ca/MgATP酶水平的影響

TCEP和TPHP觸發(fā)的代謝物譜和代謝途徑富集

通過GC-MC非靶向代謝組學(xué)對(duì)差異表達(dá)的代謝物進(jìn)行了篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)共有70種代謝物顯著差異表達(dá)。其中在最高濃度暴露48h后，TCEP誘導(dǎo)大腸桿菌中有6個(gè)上調(diào)和64個(gè)下調(diào)代謝物的合成，而TPHP暴露48h后觸發(fā)4個(gè)上調(diào)和88個(gè)下調(diào)代謝物。大部分呈下調(diào)趨勢(shì)的代謝物參與丙酮酸代謝、磷酸戊糖代謝、不飽和脂肪酸生物合成、氧化磷酸化、核糖體代謝、嘌呤代謝和氨基酸生物合成。大腸桿菌的差異調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)如圖6b所示。在TCEP和TPHP處理組中，分別只有6種和4種代謝物在TCEP and TPHP處理后同時(shí)表達(dá)。

處理后同時(shí)上調(diào)

圖6| 由TCEP和TPHP觸發(fā)的代謝物表達(dá)和代謝途徑及富集細(xì)胞代謝的差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

研究討論

TCEP和TPHP可顯著觸發(fā)大腸桿菌的氧化應(yīng)激，同時(shí)增加SOD、CAT和MDA的水平，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和抗氧化系統(tǒng)的活性。此外，TPHP比TCEP表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，這是由于兩種目標(biāo)化合物的取代模式不同所致。此外，TCEP和TPHP暴露的大腸桿菌表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS升高，膜電位和ATP酶活性降低，且呈劑量和時(shí)間依賴性。值得注意的是，上述結(jié)果證明了細(xì)胞凋亡與過度ROS積累介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。另一方面，糖酵解/糖異生、磷酸戊糖代謝、不飽和脂肪酸的生物合成，嘌呤代謝、谷胱甘肽代謝、氨基酸生物合成、丁酸代謝、丙氨酸和天冬氨酸代謝，和賴氨酸降解明顯被TCEP和TPHP干擾，表明其通過干擾代謝網(wǎng)絡(luò)和特定的分子功能，導(dǎo)致抑制系統(tǒng)發(fā)育水平。

小鹿推薦

以往有關(guān)嘔吐毒素的研究多集中在免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性等方面，而關(guān)于生長發(fā)育影響的研究較少。該研究是一篇通過大腸桿菌作為研究對(duì)象利用非靶向代謝組學(xué)來探究有機(jī)磷阻燃劑影響生物的發(fā)育和功能的高質(zhì)量的、創(chuàng)新性的的研究文章，值得學(xué)習(xí)與借鑒。

文末看點(diǎn)｜lumingbio

上海鹿明生物科技有限公司多年來，一直專注于生命科學(xué)和生命技術(shù)領(lǐng)域，是國內(nèi)早期開展以蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)為基礎(chǔ)的多層組學(xué)整合實(shí)驗(yàn)與分析的團(tuán)隊(duì)。目前在多層組學(xué)研究已經(jīng)有了成熟的技術(shù)方法

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