石蠟切片熒光TUNEL實驗步驟

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-二甲苯Ⅲ10min無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-50%酒精5min蒸餾水洗。

2、破膜：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37度溫箱孵育15-30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

3、配制TUNEL：按片子數(shù)量和組織大小取Tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1:9混合，避光待用。

4、孵育：將配制好的TUNEL加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、DAPI復(fù)染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

6、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

7、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光。）

石蠟切片熒光TUNEL結(jié)果判讀

??DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，Roche試劑盒為FITC熒光素標(biāo)記，陽性凋亡細胞核為綠色。