微流控?zé)晒夤捕ㄎ环治觯簷z測(cè)蛋白質(zhì)DNA互作
微流控共定位簡(jiǎn)介
本用戶指南將展示如何運(yùn)行基于單分子光譜學(xué)的微流控共定位研究。我們將從流動(dòng)池的準(zhǔn)備開始，并向您展示如何應(yīng)用壓力驅(qū)動(dòng)流控技術(shù)來(lái)進(jìn)行DNA檢測(cè)研究。
成像室由顯微鏡玻璃載玻片（1mm厚度，尺寸為25×75 mm）組成，上面刻有通道（一個(gè)玻璃載玻片上最多可刻9個(gè)通道），并覆蓋有矩形硼硅酸蓋玻片（厚度為0.13-0.17 mm，尺寸為60×22 mm）。由于玻片的厚度，管道的連接器直接固定在顯微鏡玻璃載玻片上。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們使用ELVEFLOW MUX液體分配閥將多種蛋白質(zhì)引入流動(dòng)池。利用這個(gè)裝置，可以實(shí)現(xiàn)順序注射的最小延遲。
硬件：
OB1流量控制器，帶有0-2000 mbar的通道
1個(gè)流量傳感器MFS2，范圍為0-7 μL/min
套件起始包：Luer鎖+1/32管道+1/32套管+定制芯片連接器
1-8個(gè)15 mL Falcon培養(yǎng)基儲(chǔ)液瓶
微流控芯片
FRET顯微鏡用于觀察
化學(xué)試劑：
20 mM Tris-HCl緩沖液，pH 7.5
50 mM鉀谷氨酸
8 mM MgCl2
4%甘油
2 mM DTT
0.1% Tween20
1 mM Trolox
蛋白質(zhì)或DNA分子（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要）
微流控芯片設(shè)計(jì)
芯片的底部采用了0.13-0.17 mm的硼硅酸蓋玻片。頂部玻璃（蓋玻片）則是傳統(tǒng)的顯微鏡玻璃載玻片。最長(zhǎng)的通道長(zhǎng)度為40 mm，最短的為20 mm。通道深度可以不同，在這里刻蝕了20 μm、30?μm和50?μm的通道。該芯片是在研究過(guò)程中通過(guò)玻璃刻蝕技術(shù)制造而成的。通道寬度為150?μm。在顯微鏡玻璃載玻片的頂部，我們鉆了進(jìn)樣孔和出樣孔。連接器是根據(jù)項(xiàng)目需求定制的。管道的外徑為1mm。
微流控共定位快速入門指南
玻璃表面處理，預(yù)組裝流動(dòng)池：
1. 用漂白劑清洗流動(dòng)池，并用硫代硫酸鈉使漂白劑失活。
2. 注入中性化親核素溶液，然后注入酪蛋白和/或牛血清蛋白溶液以關(guān)閉表面的間隙。
3. 對(duì)于“黏性”蛋白質(zhì)，通常需要預(yù)先硅烷化處理底部玻璃載玻片。
將DNA與玻璃表面鍵合：
???- 提示：在開始實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)使用凝膠過(guò)濾法對(duì)蛋白質(zhì)和DNA進(jìn)行標(biāo)記和純化?？梢哉?qǐng)求擴(kuò)展的方案（經(jīng)典蛋白質(zhì)純化）。
4. 連接OB1壓力控制器：將OB1壓力控制器通過(guò)氣動(dòng)管連接到外部壓力供應(yīng)器，并通過(guò)USB線連接到計(jì)算機(jī)。有關(guān)OB1壓力驅(qū)動(dòng)流控器設(shè)置的詳細(xì)說(shuō)明，請(qǐng)閱讀OB1用戶指南。
5. 將微流控儲(chǔ)液瓶插入OB1壓力控制器出口。關(guān)于Elveflow微流控儲(chǔ)液瓶的連接說(shuō)明，請(qǐng)參閱特定指南（見Elveflow微流控儲(chǔ)液瓶組裝說(shuō)明）。
6. 連接流量傳感器到OB1進(jìn)行反饋控制，并將流量傳感器連接在微流控儲(chǔ)液瓶和芯片之間用于流量測(cè)量。
7. 打開OB1電源開關(guān)。
8. 啟動(dòng)Elveflow軟件。Elveflow智能界面的主要功能和選項(xiàng)在智能界面指南中有詳細(xì)介紹，請(qǐng)參考該指南獲取詳細(xì)說(shuō)明。
9. 按下"Add instrument"，選擇OB1，設(shè)置為MK3+，如果需要設(shè)置壓力通道，給儀器命名，然后按下OK保存更改。現(xiàn)在，你的OB1應(yīng)該出現(xiàn)在已識(shí)別設(shè)備的列表中。
10. 首次使用需要進(jìn)行OB1校準(zhǔn)，請(qǐng)參考OB1用戶指南。
11. 添加流量傳感器：按下"Add sensor"，選擇流量傳感器，選擇模擬或數(shù)字型，設(shè)置傳感器的最大流量速率，為傳感器命名，選擇連接到哪個(gè)設(shè)備和通道，然后按下OK保存更改。詳情請(qǐng)參考微流體流量傳感器用戶指南。
12. 添加MUX分配器：按下"Add instrument"，選擇MUX分配/注射，為儀器命名，選擇閥門數(shù)量（10個(gè)或12個(gè)）。
13. 將OB1連接到多路接頭，然后將多路接頭連接到所需的所有儲(chǔ)液瓶。
14. 使用提供的1/32英寸外徑管道將微流控儲(chǔ)液瓶連接到MUX分配器，并在MUX分配器出口處連接一個(gè)管道。對(duì)于未使用的MUX進(jìn)樣口，加上一個(gè)死端阻塞器。
? ?- 提示：使用連續(xù)的MUX進(jìn)樣口連接液體儲(chǔ)液瓶和死端。MUX將按照最短路徑距離切換液體。如果MUX經(jīng)過(guò)一個(gè)打開的進(jìn)樣口，空氣將進(jìn)入系統(tǒng)。
15. 設(shè)置壓力（如果需要，設(shè)置其他參數(shù)），開始將液體注入芯片。等待所有氣泡從芯片中排除，并確保兩種液體都在流動(dòng)。
? ?- 提示：芯片引導(dǎo)：首先將液體流入管道，直到液體開始滴落，然后將它們連接到芯片。
16. 使用流量傳感器反饋回路以1μL/min的流速連續(xù)注入以下溶液（按順序注入）：
? ?a. 10 μL PBS
? ?b. 5 μL 生物素化牛血清蛋白（0.1 mg/mL PBS）
? ?c. 5 μL PBS
? ?d. 5 μL Pluoronics 0.5%
? ?e. 5 μL Neutravidin 0.2 mg/mL
? ?f. 5 μL Casein 0.02%
? ?g. 5 μL 20 kb DNA生物素（1 μL-0.5 ng）在PCB（19 μL）中
? ?- 提示：PBS為磷酸鹽緩沖鹽溶液，PCB為PBS添加了牛血清蛋白（0.4 mg/mL）和酪蛋白（0.02%）。
17. 在室溫下不流動(dòng)孵育至少15分鐘。
18. 重新啟動(dòng)連續(xù)流動(dòng)，使用以下溶液：
? ?a. 5 μL PCB
? ?b. 5 μL Neutravidin 0.2 mg/mL
? ?c. 5 μL Pluronics 0.5%
微流控設(shè)置成像：
19. 可以使用不同的顯微鏡設(shè)置，例如尼康（英國(guó)金斯頓）Eclipse Ti-E顯微鏡，配備ApoTirf 100X/1.49油，0.13-0.20工作距離為0.12的目物鏡。
20. 我們使用了功率為150 mW的488 nm激光器、150 mW的561 nm激光器（均為Coherent Sapphire Ely, 英國(guó)）和功率為100 mW的638 nm激光器（Coherent Cube），由聲光可調(diào)濾波器（Gooch and Housego, 英國(guó)）控制。
21. 每個(gè)視野大約為50 x 50?μm，通道寬度為150?μm，以觀察通道中間的分子而無(wú)任何扭曲或偽像。
該項(xiàng)目得到了歐盟Horizon 2020研究和創(chuàng)新計(jì)劃的資助，Marie Sklodowska-Curie授予協(xié)議編號(hào)為722433（DNARepairMan）。
原文鏈接：Microfluidic colocalization set-up for DNA analysis - Elveflow
