Q1：CRISPR-Cas系統(tǒng)是什么？

A1：官方：CRISPR/Cas系統(tǒng)是由規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（Clusterd regularly interspaced short palindromic repeat ,CRISPR）及CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated protein ,CAS protein）構成，該系統(tǒng)作為原核生物獲得性的“免疫系統(tǒng)”，在細菌和古細菌抵抗外來遺傳物質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要作用。

A2：說人話：CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種細菌特有的免疫系統(tǒng)。

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Q2：CRISPR和Cas代表什么意思？

CRISPR/cas結(jié)構示意圖：

CRISPR

全稱：Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats

中文：規(guī)律間隔成簇短回文重復序列

如上圖，CRISPR由一系列短的高度保守的正向重復序列（repeats）與長度相似的間隔序列（spacers）間隔排列組成。

CRISPR基因特點：

特點1 ：是一種重復的短的回文序列，長約20-40bp

特點2： 相同的序列間接重復，中間有間隔。這些間隔序列與一些病毒的序列存在同源性。

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Cas

Cas:CRISPR associated 基因，CRISPR相關基因是靠近CRISPR基因座附近的一組高度保守基因群，其所編碼的Cas蛋白，包含核酸內(nèi)切酶、解旋酶以及與核糖核酸結(jié)合的結(jié)構域，能夠識別外源DNA，通過位點特異性的切割將入侵DNA切斷。

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Q3：CRISPR-Cas系統(tǒng)是怎樣工作的？

A：簡單來說：當細菌感應到病毒DNA入侵時，細菌會產(chǎn)生兩種RNA，這兩種RNA會嵌入Cas蛋白中，即與Cas蛋白結(jié)合形成復合物，這一復合物可對病毒DNA進行特異切割。

復合物如下圖：

小Q：兩種RNA是誰呢？

A：這兩種RNA為crRNA和tracrRNA。

***crRNA:

全稱：CRISPR RNA

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***tracrRNA:

全稱： transactiving CRISPR RNA（轉(zhuǎn)錄激活crRNA）

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補充說明：

tracrRNA是由Cas蛋白上游的互補鏈轉(zhuǎn)錄來的，具有一段能同crRNA上的重復序列互補配對的序列。

成熟的crRNA通過堿基互補配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結(jié)構，指導cas蛋白在目標DNA上引起雙鏈斷裂。

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?Q4：深入了解CRISPR-Cas系統(tǒng)

A：目前將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類。

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根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個Cas蛋白形成復合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型 CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)只需要一個Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，目前Ⅱ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸酶。

CRISPR-Cas系統(tǒng)示意圖：

***我們已經(jīng)知道，CRISPR由一系列短的高度保守的正向重復序列（repeats）與長度相似的間隔序列（spacers）間隔排列組成。

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***名詞解釋：

1.Leader sequence ：前導序列

位置：在CRISPR基因第一個重復序列的上游，大約200-500bp,充當CRISPR啟動子的角色。

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2.Repeats:長度約為21-48bp,為短回文序列。即可形成發(fā)夾結(jié)構。這里是Cas蛋白的結(jié)合區(qū)域。

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3.Spacers：間隔序列。這些間隔序列與一些病毒的序列存在同源性，可以理解為是被細菌俘獲的外源DNA序列，即細菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”。

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4.Cas9:

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Cas9是由1409個氨基酸組成的多結(jié)構域蛋白，含有2個核酸酶結(jié)構域：氨基端的RuvC-like結(jié)構域及位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結(jié)構域，HNH核酸酶結(jié)構域可以切割與crRNA互補配對的模板鏈，切割位點位于PAM上游3nt處，RuvC-like結(jié)構域可以對另一條鏈進行切割, 切割位點位于PAM上游3~8nt處。在crRNA與tracrRNA形成的雙鏈RNA的指導下，Cas9蛋白對靶位點進行切割。（PAM后邊介紹）

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Q5：PAM序列

要知道：

CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas9蛋白復合體和一個短DNA序列，這個短的DNA序列通常在靶DNA的3'末端作用，被稱為PAM。

PAM：Protospaper Adjacent Motif

PAM為三個緊挨的堿基序列，最常用的為NGG三個堿基（N為任意堿基）?？蓭椭鶦as9酶識別靶序列。

PAM決定著CRISPR/Cas系統(tǒng)切割發(fā)生的位點，CRISPR/Cas系統(tǒng)與目標DNA結(jié)合后，切割就發(fā)生在PAM上游的第三個堿基處。PAM位點突變后，CRISPR/Cas系統(tǒng)對DNA的親和力降低。

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Q6:再了解一遍CRISPR-Cas9技術

A：CRISPR-Cas9技術本質(zhì)：

說人話：把Cas蛋白精確引導至特定的DNA位點上，并對這段DNA進行操作。

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前面提到：成熟的crRNA通過堿基互補配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結(jié)構，指導cas9蛋白在目標DNA上引起雙鏈斷裂。

根據(jù)這一原理，科學家創(chuàng)造出一個簡易的CRISPR系統(tǒng)：cas9蛋白+gRNA

gRNA(guideRNA,即向?qū)NA)：tracrRNA和crRNA復合體。

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gRNA會靶向病毒的基因組。cas9將復合物將切割靶向位點從而使病毒失去感染能力。

研究這發(fā)現(xiàn)這個系統(tǒng)不僅可以切割病毒DNA，而且能切割任何選定的序列位置，這可以通過對不同的靶位點設計特異的gRNA來實現(xiàn)。而這不僅可以在體外進行，也可以在活細胞的細胞核中進行。

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Q7：最后順一遍流程：

[當細菌感應到被病毒DNA入侵后，它就會產(chǎn)生兩種短RNA。其中一個短RNA與入侵病毒的DNA相匹配，之后，這兩個RNA（gRNA）與cas9蛋白形成復合物。gRNA會靶向病毒的基因組。cas9復合物將切割靶向位點從而使病毒失去感染能力。]

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即：cas9簡單理解為一種核酸內(nèi)切酶，匹配上的這段序列被稱為gRNA。一旦進入在細胞核中，該復合物會錨定在一個被稱為PAM的短序列上，cas9會將DNA解螺旋，之后，DNA會與靶RNA相結(jié)合。如果堿基完全匹配，cas9蛋白則會對DNA進行切割。當切割發(fā)生后 ，細胞會試圖對切口進行修復，但是這種修復容易出錯，由修復產(chǎn)生的突變會使基因失活。

最后，該基因沉默。

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