作者︱王筱童 鄭梅君 肖愷豐

來源︱Bio-protocol第三屆生物實驗短視頻大賽

果蠅是神經(jīng)生物學(xué)研究中重要的模式生物，其具有神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、培養(yǎng)簡便、生長周期短等諸多優(yōu)勢。此外，果蠅具有豐富多樣的行為模式，這一特性使得其被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控行為的研究中。1960年Benzer實驗室開發(fā)了一系列果蠅行為學(xué)實驗范式，用于睡眠節(jié)律等多種行為相關(guān)調(diào)控基因的研究[1]，這開創(chuàng)了果蠅用于行為學(xué)研究的先河。在此后的研究中，各大實驗室也開發(fā)了多樣的行為學(xué)實驗范式。如今，已有豐富的行為學(xué)實驗范式用于研究果蠅的進食、求偶、睡眠、打斗等本能行為，以及學(xué)習(xí)記憶、決策等復(fù)雜行為。

在果蠅的進食行為中，存在多個不同階段，其中具有多樣的神經(jīng)調(diào)控機制。一個完整的進食過程存在六個階段，分別是覓食、靠近食物、進食起始、食物消化、進食終止，最后遠離食物。為了研究神經(jīng)環(huán)路如何影響進食行為的各個階段，已有染料法檢測進食量[2]、毛細玻璃管CAFé法檢測進食量[3]、FlyPad檢測果蠅進食頻率[4]、dFRAME監(jiān)測果蠅進食活動性[5]等多種方法。與此同時，除了上述對進食過程的量化實驗外，對果蠅感受食物線索后做出進食決策能力也存在著相關(guān)的成熟行為學(xué)范式，即本視頻所呈現(xiàn)的果蠅展吻反射（Proboscis extension reaction, PER）范式。

在PER范式中，被固定的果蠅會對反復(fù)呈現(xiàn)于其口器上的液體食物線索進行反饋，即是否伸展吻部繼續(xù)進食。這一伸展吻部的過程被稱為展吻反射。果蠅產(chǎn)生展吻反射的次數(shù)可以用于量化果蠅對食物的喜好程度或進食欲望。這一范式操作相對簡單，并能與光遺傳學(xué)等多種神經(jīng)元操控工具相結(jié)合，實現(xiàn)對果蠅進食決策中各神經(jīng)元功能的研究。

一、實驗樣品與試劑儀器

1. 樣品信息

果蠅：本實驗采用野生型w1118果蠅；在實際實驗中，可使用其他轉(zhuǎn)基因果蠅。

2. 試劑和耗材

耗材：1000 μL吸頭一支，200 μL吸頭若干，尖頭棉簽或濾紙條，脫脂棉，紗布，刀片，尖頭鑷子，長塑膠軟管，太空沙板或其他軟板，濕盒，果蠅固定手柄。

試劑：瓊脂粉，面包酵母。

3. 儀器和軟件

儀器：體視鏡一臺，用于果蠅的顯微操作和觀察。

軟件：GraphPad Prism 8用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖。

二、實驗操作

1. 果蠅的預(yù)處理

1.1 配制瓊脂食物：將1 g瓊脂粉融化于100 mL蒸餾水中，充分煮沸后倒入小管內(nèi)，冷卻凝固后備用。

1.2 饑餓果蠅：將果蠅倒入瓊脂食物中饑餓，饑餓時長視實驗條件及果蠅反應(yīng)而定，一般為24-36小時。

2.?果蠅的固定

2.1 制作套管：取一根200 μL吸頭，切去前端；夾取一小塊紗布，用200 μL吸頭的尾部將紗布推入大吸頭中，并將1000 μL吸頭前端切去約2 mm便于果蠅通過。

2.2 將果蠅轉(zhuǎn)移頭套在塑膠軟管末端，塑膠軟管另一端由操作者含入口中。將轉(zhuǎn)移頭插入果蠅饑餓管內(nèi)，吸取單只果蠅進入轉(zhuǎn)移頭。

2.3 拔出轉(zhuǎn)移頭，輕輕吸氣防止果蠅逃逸。

2.4 取一支200 μL吸頭（后稱固定頭）套于轉(zhuǎn)移頭上，輕輕甩動吸頭，使果蠅進入固定頭

2.5 果蠅進入固定頭后，將吸頭微微立起并用力吹氣，將果蠅卡到固定頭前端狹窄位置至其無法移動。

2.6 將刀片放至果蠅胸節(jié)靠上的位置，接著輕輕吸氣，讓果蠅向后移動，并切去槍頭尖端。

2.7 吹氣，使果蠅牢牢卡在前，使果蠅頭部完全露出。

2.8 切去固定頭后節(jié)，只留前端5 mm - 1 cm左右。

2.9 撕一小塊脫脂棉，用鑷子輕輕推入固定頭，注意塞脫脂棉時不要太用力。

2.10 固定完畢后，將果蠅豎直插入太空沙板或其他軟板中，重復(fù)步驟2.2-2.9固定該組剩下的果蠅。

2.11 待整組果蠅都固定完畢后，將果蠅板放入濕盒中，在安靜處避光恢復(fù)30-60分鐘。

3.?檢測

3.1 食物溶液的配制：本實驗中采用10%的酵母溶液，將0.1 g酵母干粉與1 mL蒸餾水混合，使用渦旋振蕩器完全混勻。

3.2 用鑷子從軟板上夾取一只果蠅，放置于可塑土手柄中（手柄使用可塑黏土制作，其前端剛好能夠容納固定頭，從而防止固定頭在板上滾動）

3.3 調(diào)整體視鏡焦距至能清晰觀察到果蠅，在鏡下觀察并調(diào)整果蠅位置，輕輕轉(zhuǎn)動果蠅至其側(cè)躺在板上，以清晰地觀察到果蠅的口器伸縮。

3.4 使用尖頭棉簽或濾紙片蘸取蒸餾水，盡量平穩(wěn)地靠近果蠅口器末端唇瓣，使果蠅伸出口器自由飲水。保持棉簽平穩(wěn)至果蠅不再飲水。

3.5 使用尖頭棉簽或濾紙蘸取酵母食物，輕輕靠近果蠅口器，與口器接觸后迅速回撤，記錄果蠅展吻情況（若不展吻，則將行為反應(yīng)記為0；若展吻，則記為1）。連續(xù)進行10次刺激，計算果蠅的總展吻次數(shù)。注意，食物靠近果蠅口器后應(yīng)立刻撤下，防止果蠅進食食物

3.6 重復(fù)步驟3.2 - 3.5，完成整組測試。

3.7 對行為反應(yīng)指數(shù)進行分析、作圖。

三、注意事項

在PER反應(yīng)的記錄中，應(yīng)使果蠅的反應(yīng)盡可能接近自然，因此需要保證固定時擠壓果蠅力度較輕，濕盒內(nèi)恢復(fù)適應(yīng)時間足夠長。

此外，在檢測時，應(yīng)將刺激局限于口器唇瓣上，避免讓果蠅進食食物。這樣可以排除腸道等復(fù)雜信號的調(diào)控，以及隨著檢測時間延長果蠅飽腹感的變化對實驗結(jié)果的影響。

此外，提供可能出現(xiàn)問題的解決方案：

1. 提供食物后果蠅不產(chǎn)生PER反應(yīng)：可以嘗試延長饑餓時間，或檢查食物是否有效。

2. 不提供食物也產(chǎn)生PER反應(yīng)：首先考慮果蠅的個體差異，并考慮延長食物刺激間的間隔時間，確保每次刺激后都有三秒以上的時間令果蠅恢復(fù)反應(yīng)。此外，食物氣味也會影響果蠅的PER反應(yīng)，尤其是酵母等含濃郁氣味的食物可能會在靠近時直接引發(fā)展吻反應(yīng)。為了避免食物氣味的影響，可以在通風(fēng)箱完成實驗。

3. 果蠅的反應(yīng)個體差異過大：首先考慮延長饑餓時間，使果蠅的饑餓水平達到同一程度。其次，考慮加快測試速度，從而使前后進行實驗的果蠅有相似的反應(yīng)最后，還可以在實驗中穿插水刺激，若果蠅對水刺激有反應(yīng)，則可以去掉該組數(shù)據(jù)。

四、結(jié)果分析

在實驗記錄中，對單只果蠅連續(xù)進行10次刺激，得到每只果蠅對應(yīng)的總展吻次數(shù)，作為該果蠅的行為反應(yīng)指數(shù)。若對單只果蠅給予多種食物刺激（如酵母和蔗糖），可對單只果蠅的不同反應(yīng)進行配對T檢驗。

五、作者與導(dǎo)師簡介

作者：

王筱童，中國科學(xué)院生物物理研究所腦與認(rèn)知國家重點實驗室李巖課題組直博二年級在讀，課題內(nèi)容主要關(guān)注果蠅進食相關(guān)信息由外周向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的輸入機制，以及中樞整合神經(jīng)環(huán)路的解析。

導(dǎo)師：

李巖，中國科學(xué)院生物物理研究所研究員，百人計劃，博士生導(dǎo)師，腦與認(rèn)知國家重點實驗室課題組長。李巖研究組以果蠅為動物模型，涉及的研究領(lǐng)域和方法包括神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、學(xué)習(xí)認(rèn)知行為的神經(jīng)環(huán)路等。該研究組致力于以已有的行為范式為基礎(chǔ)，探索高級腦功能的細胞分子機制，在認(rèn)知、行為調(diào)控的神經(jīng)環(huán)路和關(guān)鍵因子，及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和疾病等領(lǐng)域開展了深入的、原創(chuàng)性的工作。

六、參考文獻

1. Konopka, R. J., & Benzer, S. (1971). Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 68(9), 2112–2116.

2. Bai, X. B., et al. (2019). Blue Dye Assay to measure Food Consumption of Adult Drosophila under Different Nutrition Conditions. Bio-101: e1010266.

3. Ja, W. W., et al. (2007). Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(20), 8253–8256.

4. Itskov, P. M.,et al. (2014). Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature communications, 5, 4560.

5. Niu, M. X., et al. (2021). dFRAME: A Video Recording-Based Analytical Method for Studying Feeding Rhythm in Drosophila. Frontiers in genetics, 12, 763200.

Bio-protocol 簡介? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

Bio-protocol于2011年在斯坦福大學(xué)創(chuàng)建, 致力于搭建全球權(quán)威的、高質(zhì)量的生物實驗方案分享平臺，以助力科學(xué)發(fā)現(xiàn)。Bio-protocol期刊是Bio-protocol旗下的一份同行評審的國際學(xué)術(shù)期刊，發(fā)表高質(zhì)量的生命科學(xué)實驗方案，旨在提高科研的可重復(fù)性。至今，Bio-protocol已發(fā)表了來自全球上萬名優(yōu)秀科研工作者（包括多名諾貝爾獎獲得者）的4000多篇實驗方案，并且同 Science、eLife等12家國際權(quán)威科學(xué)雜志建立長期合作關(guān)系，共同促進生命科學(xué)研究的可重復(fù)性。2019年Bio-protocol期刊已被PubMed Central，ESCI收錄。

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