寫在前面

????????今天推薦的是由美國貝勒醫(yī)學(xué)院Dan L. Duncan癌癥中心在2019年4月13日發(fā)表于Molecular Cancer Therapeutics（2020IF：6.261，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Jed G. Nuchtern教授，研究表明抑制泛素特異性蛋白酶14可抑制細(xì)胞增殖并與化學(xué)治療藥物協(xié)同作用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤。

研究背景

????????神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見的顱外惡性實(shí)體瘤，耐藥是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因。蛋白酶體活性升高在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)展和對(duì)常規(guī)化療的抵抗中起著重要作用。泛素特異性蛋白酶14 (USP14) 是與蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基相關(guān)的三種去泛素酶之一，正在成為多種腫瘤類型的潛在治療靶點(diǎn)。然而，USP14在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的作用尚未闡明。

摘要部分

????????作者發(fā)現(xiàn)USP14在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的抑制作用是通過敲低或特異性抑制劑如b-AP15通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞增殖。此外，b-AP15顯著抑制NGP和 SH-SY5Y 異種移植小鼠模型中的神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤生長。對(duì)于聯(lián)合治療，b-AP15聯(lián)合常規(guī)化療藥物如阿霉素或VP -16對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。作者的研究表明USP14是細(xì)胞活力所必需的，并且是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的新治療靶點(diǎn)。此外，由于USP14在治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤方面的強(qiáng)大協(xié)同作用，抑制USP14可能作為聯(lián)合治療的一種有效策略。

研究內(nèi)容

1.USP14基因敲除可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

????????為了確定USP14在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的作用，作者探究了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系子集中的內(nèi)源性USP14蛋白水平。免疫印跡分析顯示USP14在所有測(cè)試的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)。接下來，作者使用USP14 shRNA敲低多個(gè)腫瘤細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有六種細(xì)胞系的細(xì)胞增殖抖受到抑制，而對(duì)非腫瘤細(xì)胞系HS-5和HEK293沒有影響。作者隨后探究了USP14敲低是否影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的細(xì)胞周期分布。數(shù)據(jù)顯示USP14表達(dá)降低對(duì)NGP和SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展幾乎沒有影響。

????????為了進(jìn)一步了解USP14敲除對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的抑制作用的分子機(jī)制，作者通過western blot來檢測(cè)剪切的caspase-3和PARP（細(xì)胞凋亡的指標(biāo)）。作者的數(shù)據(jù)顯示，在USP14敲除的IMR-32、NGP和SK-N-AS細(xì)胞中觀察到高水平的caspase 3和PARP剪切帶，而在USP14敲除的SH-SY5Y、LAN-6和SK-N-BE2細(xì)胞中caspase 3和PARP的剪切較少。表明USP14的抑制部分通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制了細(xì)胞增殖。除了USP14，UCHL5和PSMD14也通過去除多聚物蛋白底物的泛素來調(diào)節(jié)真核26S蛋白酶體復(fù)合物的功能。作者研究了這些DUBs在神經(jīng)母細(xì)胞增殖中的作用。作者發(fā)現(xiàn)，UCHL5敲除對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖沒有影響。然而，PSMD14的抑制確實(shí)導(dǎo)致了細(xì)胞增殖的減少。

研究結(jié)論：USP14基因敲除可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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2.USP14基因敲除可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的錨定生長

????????作者接下來進(jìn)行了soft-agar測(cè)試實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)USP14敲除對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞錨定依賴性生長的影響。USP14敲除導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的錨定依賴性生長受到明顯抑制。這些結(jié)果表明，USP14在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中起著重要作用。

研究結(jié)論：USP14基因敲除可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的錨定依賴性生長。

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3.USP14抑制劑b-AP15抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖

????????為了進(jìn)一步研究USP14敲除對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，作者用b-AP15（小分子USP14去泛素酶抑制劑）在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中進(jìn)行測(cè)試。細(xì)胞活力測(cè)試顯示，在所有測(cè)試的細(xì)胞系中，細(xì)胞增殖以劑量依賴的方式被明顯抑制。IMR-32和LAN-6細(xì)胞更敏感，而SK-N-BE2和SK-N-AS對(duì)b-AP15處理更耐藥。這些結(jié)果表明，b-AP15的主要作用方式與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的MYCN狀態(tài)無關(guān)。此外，b-AP15誘導(dǎo)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化。另一方面，作者發(fā)現(xiàn)在用b-AP15處理的六個(gè)細(xì)胞系中形成的克隆明顯減少。作者進(jìn)一步評(píng)估了b-AP15對(duì)非腫瘤細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)HS-5和HEK-293細(xì)胞的IC50值明顯高于神經(jīng)母細(xì)胞。這些結(jié)果表明，USP14的抑制會(huì)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。

研究結(jié)論：USP14抑制劑b-AP15抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致泛素化蛋白的積累，并誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的UPR。

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4.抑制USP14導(dǎo)致泛素化蛋白的積累并誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）??? ?

????????以前的研究表明，阻斷USP14 DUB的活性會(huì)增加許多細(xì)胞類型中的細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白。泛素化蛋白的積累啟動(dòng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）壓力，進(jìn)一步導(dǎo)致依賴caspase的細(xì)胞凋亡。因此，作者研究了UPS14的抑制是否會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤中泛素化蛋白的增加。在USP14敲除的NGP和SH-SY5Y細(xì)胞中檢測(cè)到泛素化蛋白明顯增加。與此相一致的是，在這兩個(gè)用b-AP15處理的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白的積累。另一方面，伴隨著ER應(yīng)激，泛素化蛋白也會(huì)誘發(fā)UPR，從而增加HSP的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)，用sh-RNAs或b-AP15抑制USP14會(huì)導(dǎo)致NGP和SH-SY5Y細(xì)胞中HSP70和HSP40的表達(dá)增加。

研究結(jié)論：抑制USP14導(dǎo)致泛素化蛋白的積累并誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。

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5.b-AP15與傳統(tǒng)化療藥物對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤有協(xié)同抗癌作用? ? ?

????????提高當(dāng)前化療療效和克服已建立的化療耐藥性的能力對(duì)于高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者至關(guān)重要。作者探究了USP14抑制劑b-AP15是否可以與阿霉素和 VP-16 對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用。如表1所示，作者發(fā)現(xiàn)幾乎所有劑量組合對(duì)測(cè)試細(xì)胞都有協(xié)同抗腫瘤作用。事實(shí)上，對(duì)多柔比星和耐VP-16的LAN-6細(xì)胞有更強(qiáng)烈的協(xié)同抗癌作用。在另一個(gè)抗性細(xì)胞系SK-N-BE2中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

????????為了更深入地了解分子機(jī)制，作者用免疫印跡法檢測(cè)b-AP15與多柔比星或VP-16在SK-N-BE2和LAN-6細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。作者發(fā)現(xiàn)，b-AP15處理可以大大增強(qiáng)Dox-和VP-16誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。作者的數(shù)據(jù)有力地證明了USP14抑制作為一種輔助治療方案的潛力。

研究結(jié)論：b-AP15與傳統(tǒng)化療藥物對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤有協(xié)同抗癌作用。

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6.USP14抑制劑b-AP15可抑制體內(nèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長? ? ?

????????作者的體外數(shù)據(jù)表明USP14是神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長所必需的。接下來，作者探究了USP14是否也是體內(nèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長所必需的。作者將具有熒光素酶表達(dá)的NGP和 SH-SY5Y細(xì)胞注射到裸鼠左腎囊中產(chǎn)生的原位神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型。術(shù)后兩周，用生物發(fā)光成像檢查腫瘤生長。攜帶具有相似生物發(fā)光強(qiáng)度的腫瘤的小鼠被隨機(jī)分為兩個(gè)治療組：DMSO或b-AP15。作者發(fā)現(xiàn)b-AP15顯著抑制腫瘤生長并導(dǎo)致腫瘤重量顯著降低。然后，通過IHC染色結(jié)果顯示b-AP15顯著抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步評(píng)估b-AP15對(duì)體內(nèi)腫瘤生長的影響，作者用b-AP15處理具有相似腫瘤信號(hào)的4周術(shù)后小鼠。通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，b-AP15在神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

研究結(jié)論：USP14抑制通過誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡來抑制體內(nèi)腫瘤生長。

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7.USP14抑制劑b-AP15可抑制體內(nèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長

????????在許多惡性腫瘤中，USP14的過度表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生有關(guān)。為了驗(yàn)證這些觀察結(jié)果并進(jìn)一步探索USP14 mRNA水平與神經(jīng)母細(xì)胞瘤生存期的相關(guān)性，作者使用R2基因組學(xué)分析和可視化平臺(tái)分析現(xiàn)有數(shù)據(jù)中神經(jīng)母細(xì)胞瘤隊(duì)列中的USP14表達(dá)。沒有發(fā)現(xiàn)USP14 mRNA水平與總生存期和無事件生存期有明顯相關(guān)性。此外，作者發(fā)現(xiàn)MYCN擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和MYCN未擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤之間沒有檢測(cè)到USP14 mRNA水平的明顯差異。然而，與較低階段的腫瘤相比，晚期IV期的神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤的USP14 mRNA水平明顯較高。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)第四階段的USP14 mRNA水平比其他階段的低。因此，神經(jīng)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中進(jìn)一步研究USP14蛋白水平與臨床結(jié)果之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

研究結(jié)論：USP14 mRNA水平在IV期神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者樣本中較高。

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結(jié)論與討論

????????作者的研究表明, USP14是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，抑制USP14可抑制體外和體內(nèi)的腫瘤生長。此外，抑制USP14可以克服化療抵抗，并與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物協(xié)同治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤。然而，抑制USP14的協(xié)同抗腫瘤活性的確切機(jī)制還有待于繼續(xù)探究。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-18-0146