No.1 切片染色深

問題原因:一抗?jié)舛冗^高是造成切片染色深常見的原因之一。

解決方法:是在每次使用新抗體前對(duì)其工作該度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己寸驗(yàn)室的理相工作濃度，包括

即用型的抗體也同樣需要進(jìn)行測(cè)試，不能只簡(jiǎn)單的按照說(shuō)明書進(jìn)行染色，

No.2 時(shí)間過長(zhǎng)或溫度過高影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

問頻原因:忽視操作規(guī)程，沒有嚴(yán)格控制時(shí)間，因遺忘而造成時(shí)同延長(zhǎng)或溫度過高

解決方法:實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身像帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒。規(guī)在流行的二步法敏感性很高，要求一

抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是 30 分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

No.3 DAB顯色不理想

問題原國(guó):DAB 變質(zhì)或顯色時(shí)間太長(zhǎng)。

解決方法:DAB 最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣，應(yīng)進(jìn)行過濾后再使用，當(dāng)染色片太多或使用染色機(jī)，導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)進(jìn)行終止操作時(shí)，也應(yīng)該盡量對(duì)新的，或使用頻率不高的抗體，進(jìn)行顯色時(shí)的監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長(zhǎng)。

配子的 DAB 不應(yīng)存放時(shí)間大長(zhǎng)，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過復(fù)化包也會(huì)游商出策原子片 DAB 產(chǎn)生反內(nèi)，從而降低 DAB 的效力:像未用棄的 DAB 存放在水箱里，乘要的時(shí)候再取用的這種行為也是不可取的，DAB 的顯色是好在是微鎮(zhèn)下監(jiān)控，符達(dá)到理想的染色程府時(shí)，應(yīng)立即終北反應(yīng)。

No.4 組織變干

問題原因:修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因

解決方法:實(shí)驗(yàn)人員在操作過程中要做到仔細(xì)認(rèn)真，井采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫圈，達(dá)到有效的避免液體流失，提高操作速度的效果。

No.5 切片背景著色

問題原因:切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間大于 24 小時(shí)，并切放置在室溫下，特別是炎熱的夏天，就會(huì)出現(xiàn)背景著色。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在 40C冰箱過夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響。

解決方法:室溫下不可存放時(shí)間太長(zhǎng)，尤其是夏天，切片和修復(fù)液如需過夜，最好存放在 40C 冰箱內(nèi)。

No.6 切片不顯色或者背景著色

問題原因:一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體，是導(dǎo)致切片不顯色或者背景著色的主要原因

解決方法:一定要注意一抗的有效期，用新買抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過的抗體作比較。

No.7 非特異性染色

問題原因:忘記血清封閉，在免疫組化中使用封閉血清，可以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性和降低背景。

解決方法:封閉血清一般選擇和二抗來(lái)源相同的，因此常用山羊血清，有時(shí)也會(huì)使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不可與一抗來(lái)源相同。

No.8 操作過程中脫片

(1)可能是黏附載玻片質(zhì)量的問題，建議嘗試更換載玻片。

(2)組織切的不好，可能是切片機(jī)刀片較鈍造成切片切的厚、不均勻，或者是切片機(jī)操作者手法不熟練等。

(3)可能是組織的問題，比如癌癥組織有壞死情況時(shí)，也容易造成脫片。

(4)烘烤結(jié)果不理想，可能是烘烤時(shí)間較短或溫度不夠等。

(5)操作時(shí)甩動(dòng)幅度過猛，有脫片嫌疑的切片最好不甩或輕輕甩，可用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水

(6)修復(fù)過程出現(xiàn)問題，比如在抗原修復(fù)時(shí)，高壓時(shí)間過長(zhǎng)，或者放進(jìn) 100 度修復(fù)液時(shí)不夠平穩(wěn)，也容易

出現(xiàn)脫片的情況。此外，用 EDTA 修復(fù)比檸檬酸更容易脫片。

(7)一旦見到有組織漂起來(lái)，在操作時(shí)就要更加謹(jǐn)慎，使用 PBS 的時(shí)候盡量泡，不要沖。