? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖1髓系BRD9的缺失導致骨量減少

確認BRD9缺失后會導致骨量減少后，作者研究了破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成，發(fā)現(xiàn)LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠在4周齡時破骨細胞數(shù)量和大小增加，骨形成率與對照小鼠相當，但骨表面侵蝕更多，因此作者推斷BRD9缺失后會促進破骨細胞形成。那么BRD9是如何抑制破骨細胞形成的呢？作者先是提取4周齡的LysM-Cre;Brd9fl/fl和對照小鼠的BMDMs，使用RANKL體外誘導破骨細胞，2天后，與對照BMDMs相比，敲除BRD9的BMDMs中TRAP水平升高，破骨細胞的數(shù)量和大小增加（圖2a），破骨特異性基因Acp5、CTSK和MMP9的表達增加（圖2b，c）。

接著作者使用BRD9的化學抑制劑iBRD9誘導破骨細胞形成，經(jīng)過濃度摸索，最終選擇了能夠顯著促進破骨細胞形成的濃度為1 μM（圖2d，e，f）。作者使用M-CSF處理BMDMs，并設置了四組實驗：對照組（M+vector），iBRD9誘導組（M+iBRD9），RANKL誘導組（MR+vector），RANKL和iBRD9同時誘導組（MR+iBRD9），并檢測這4組BMDMs中FOS、CTSK的蛋白水平以及ACP5和MMP9的mRNA水平，結(jié)果顯示抑制劑iBRD9在沒有RANKL誘導的情況下對破骨細胞的形成沒有顯著影響，這表明BRD9發(fā)揮功能依賴于RANKL（圖2g，h）。實驗結(jié)果表明BRD9以負反饋機制對RANKL誘導的破骨細胞分化進行抑制調(diào)控，BMDMs中BRD9基因缺失和抑制均能促進破骨細胞分化。

圖2 BMDMs中BRD9的缺失和抑制導致體外破骨細胞形成過度激活

為了進一步研究BRD9介導的抑制RANKL誘導破骨細胞分化的反饋機制，作者使用M-CSF和RANKL誘導破骨細胞，并分為兩組，一組使用iBRD9（MR + iBRD9），另一組不做處理（MR +vector），1天后進行mRNA seq。結(jié)果顯示，MR + iBRD9組BMDMs中共有211個基因下調(diào)和183個基因上調(diào)，如熱圖和散點圖所示（圖3a）。利用GO分析MR + vector和MR + iBRD9實驗組，發(fā)現(xiàn)這些基因在免疫反應、對干擾素-β （IFN-β）和外部刺激的反應、免疫系統(tǒng)過程及其拓撲關(guān)系上都有強烈的富集（圖3b）。基因集富集分析（GSEA）進一步發(fā)現(xiàn)，MR+iBRD9組IFN-β反應、乙酰膽堿受體信號傳導、免疫受體活性顯著減弱，而核糖體生物發(fā)生、突觸傳遞和rRNA加工增強（圖3c，d）。

在破骨細胞形成過程中，RANKL激活I(lǐng)FN-β信號，IFN-β、STAT1、STAT2上調(diào)（圖3e），而iBRD9處理后，在RANKL誘導的BMDMs中，IFN-β信號活性下調(diào)（圖3f）。因此，作者推測在BRD9抑制后，BMDMs中轉(zhuǎn)錄下調(diào)的IFN-β信號可能導致破骨細胞過度形成。為了驗證這一假設，我們將IFN-β1細胞因子加入到BRD9抑制的BMDMs中，發(fā)現(xiàn)BRD9抑制后導致的破骨形成增加在IFN-β信號上調(diào)后得到控制，表現(xiàn)為Acp5和Mmp9的破骨生成基因表達下調(diào)（圖3g），TRAP +分化的破骨細胞數(shù)量和大小減少（圖3h）。因此，BMDMs中IFN-β信號的轉(zhuǎn)錄激活可能有助于破骨細胞發(fā)生過程中BRD9介導的負反饋。

圖3 BRD9介導的干擾素- β信號的轉(zhuǎn)錄激活負調(diào)控破骨細胞的形成

為了闡明BRD9在RANKl處理的破骨細胞中的負反饋機制，作者通過chip-seq比較RANKl處理的iBRD9抑制基因轉(zhuǎn)錄與破骨細胞發(fā)生過程中BMDMs中BRD9的結(jié)合譜進行了比較。有717個基因在BRD9受到抑制后表達下調(diào)（圖4a）。對上述基因進行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)BRD9的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控在信號轉(zhuǎn)導、信號分子、相互作用和免疫應答等通路富集（圖4b）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析進一步確定了基因列表中的幾個關(guān)鍵樞紐基因，是破骨細胞形成的負反饋調(diào)節(jié)過程中BRD9的潛在直接下游靶點（圖4c）。其中，STAT1是相互作用次數(shù)最多的樞紐基因之一，在RNAKl誘導后，STAT1在體內(nèi)和體外的破骨細胞中表達均有上調(diào)（圖3e，4d，e）。而與對照組相比，在RANKl誘導后，LysM- Cre;Brd9fl/fl小鼠BMDMs中STAT1的表達下調(diào)（圖4f），在BRD9抑制后，野生型小鼠BMDMs中STAT1的基因表達也下調(diào)（圖4g和h）。接著作者構(gòu)建了可穩(wěn)定表達STAT1的RAW264.7，以研究iBRD9抑制劑的功能。作者發(fā)現(xiàn)，未表達STAT1且未使用iBRD9處理的對照組中，破骨相關(guān)基因MMP4、ACP4、FOS的表達量與表達STAT1且使用iBRD9處理實驗組和表達STAT1但未使用iBRD9處理的實驗組相當，但在未表達STAT1且使用iBRD9處理的RAW264.7中破骨相關(guān)基因的表達量明顯上升（圖4j）。另外作者發(fā)現(xiàn)iBRD9處理后，STAT1啟動子和增強子的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降（圖4k）。在破骨細胞誘導的RAW264.7細胞中進行ChIP-qPCR，結(jié)果顯示BRD9可以直接結(jié)合STAT1的啟動子和增強子（圖4l）。以上實驗結(jié)果表明BRD9通過直接調(diào)節(jié)STAT1的啟動子和增強子活性來促進STAT1的轉(zhuǎn)錄。

圖4 STAT1對破骨細胞發(fā)生過程中BRD9介導的負反饋至關(guān)重要

然后，作者進行了染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶開放性高通量測序（ATAC-seq）和基序分析，來研究BRD9的染色質(zhì)重塑功能以及可能促進BRD9對破骨細胞產(chǎn)生負作用的輔助因子。BRD9抑制組染色質(zhì)開放性譜發(fā)生了顯著變化，對照組有12988個峰，BRD9抑制組有10795個峰，其中重疊峰有5092個（圖5a，b）。進一步比較兩組間的差異開放區(qū)域（DARs）， BRD9抑制后得到3155個DARs開放性增加，2489個DARs開放性降低（圖5c）。BRD9抑制后染色質(zhì)開放圖譜的變化表明，除了IFN-β信號通路外，BRD9介導的破骨細胞發(fā)生的負調(diào)控也可能被多個過程影響。

為了確定破骨細胞形成過程中BRD9潛在的相互作用轉(zhuǎn)錄因子，作者使用ATAC-seq（圖5e）將BRD9抑制后最富集的缺失基序與ChIP-seq中BRD9結(jié)合位點富集基序進行比較。在BRD9結(jié)合位點富集而BRD9抑制后缺失的基序有：MXI1、SRY、Arid3a、ZNF354C、FOXP1等，這些TF可能與BRD9相互作用（圖5f）。作者發(fā)現(xiàn)FOXP1在股骨遠端生長板下的分泌CTSK的破骨細胞和正常破骨細胞中表達（圖5h，i）。因此，作者推測FOXP1可能在破骨細胞形成過程中參與BRD9的抑制功能。作者先做了IP實驗，發(fā)現(xiàn)BRD9和FOXP1在破骨細胞分化過程中相互作用（圖5j）。為了進一步驗證FOXP1在STAT1上的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，作者利用進行了ChIP-qPCR和FOXP1敲低實驗。實驗結(jié)果顯示FOXP1可以直接結(jié)合STAT1啟動子和增強子，而FOXP1在STAT1上的結(jié)合功能在BRD9抑制后減弱（圖5k）。利用慢病毒敲低Foxp1導致Stat1下調(diào)，同時與對照慢病毒組相比，破骨細胞分化基因上調(diào)，BRD9的調(diào)控功能起效（圖51）。我們進一步排除了BRD9缺失或抑制后Foxp1基因表達下調(diào)導致Stat1結(jié)合和調(diào)節(jié)功能受損的可能性，如在rankl誘導后LysM-Cre;BRD9fl/fl小鼠中Foxp1基因表達與對照小鼠相比相當（圖5m），以及在BRD9抑制后野生型小鼠的BMDMs中Foxp1基因表達水平無明顯變化（圖5n）。以上結(jié)果表明FOXP1是BRD9在STAT1轉(zhuǎn)錄激活及其在破骨細胞分化過程中的負反饋調(diào)控的關(guān)輔助因子之一（圖5o）。

圖5 FOXP1與BRD9相互作用，在破骨細胞形成過程中調(diào)節(jié)STAT1轉(zhuǎn)錄

ZOL相關(guān)的ONJ與拔牙后患者破骨細形成過程受損有關(guān)，需要長期服用強抗骨吸收劑。此外，最近的研究也揭示了ONJ的發(fā)病機制也與巨噬細胞過度活化和炎癥有關(guān)。先前有研究證明了化學藥物PROTAC dBRD9（dBRD9降解劑）在滑膜肉瘤和白血病的臨床前模型中的療效，因此，作者推測使用具有促進破骨細胞形成和抗炎反應的dBRD9降解劑（這個降解劑是PROTAC嗎[1]?）進行局部治療可以有效預防或減輕ONJ。為了驗證這一假設，作者給6周齡WT C57BL/6J小鼠注射ZOL（125 μg/kg體重；每周2次）和DEX（糖皮質(zhì)激素/地塞米松）（5mg /kg體重；每周一次）。首次注射ZOL/DEX 2周后，拔除小鼠上頜左第一磨牙。接著，作者構(gòu)建了含有dBRD9降解劑的改良光固化SF（絲素蛋白）材料，在拔牙后立即填充到牙槽骨窩中，并以SF空載為對照組。兩周后，收集各組上頜骨進行評估（圖6a）。

顯微CT成像評估牙槽骨愈合情況顯示，onj對照組小鼠的磨牙拔牙部位骨膜反應嚴重（圖6b，箭頭1），上頜竇底骨過度（圖6b，箭頭2），骨填充量不足充滿骨屑，骨硬化嚴重（圖6b，箭頭3）。而來自ONJ-dBRD9組的小鼠的磨牙拔牙槽內(nèi)長滿了新形成的小梁骨（圖6b），與onj 對照組的小鼠相比，骨壞死和骨膜反應的發(fā)生率降低了60%（圖6c）。組織學檢查結(jié)果顯示，對照小鼠壞死的牙槽骨有空腔隙（圖6d，星號），而dBRD9組無明顯空腔隙，且愈合的拔牙窩骨組織結(jié)構(gòu)組織良好（圖6d，箭頭）。

TRAP染色和定量分析顯示，與對照組相比，dBRD9降解劑處理組在愈合的牙槽骨表面參與骨重塑的破骨細胞局部增加（圖6e，f）。TNF-α（圖6h）和CD66（圖6i）顯示，與對照組相比，dBRD9降解劑治療組拔牙槽愈合后骨表面炎癥反應局部減輕。

應用dBRD9治療ZOL誘導的ONJ效果良好，這一結(jié)果促使作者進一步探索在破骨細胞生成和巨噬細胞激活過程中，BRD9的功能與發(fā)病機制之間的潛在聯(lián)系。在rankl誘導的破骨細胞生成和脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞激活過程中，ZOL處理可導致bmdms中BRD9的表達上調(diào)（圖6j），而STAT1作為BRD9的關(guān)鍵下游靶點之一，在dBRD9降解劑處理組體內(nèi)較對照組下調(diào)（圖6k）。因此將dBRD9應用于zol誘導的ONJ是一種潛在的理想的治療方法，為未來長期服用ZOL的患者預防或有效緩解ONJ提供了一個新的治療方向。

圖6 BRD9降解物減輕拔牙后ZOL相關(guān)的ONJ

我們以LPS誘導的牙周牙槽骨損失為模型，評估brd9缺失小鼠骨組織中炎癥反應和RANKL表達以及破骨細胞活性的變化（圖7a）。與對照小鼠相比，攜帶骨質(zhì)疏松表型（圖7b，c，星號）的Brd9缺失小鼠對LPS/結(jié)扎刺激的牙周牙槽骨局部急性損傷（圖7b-d）和破骨細胞活性（圖7e，f）表現(xiàn)出抵抗性。如TNF-α、iNOS和RANKL的免疫熒光染色結(jié)果所示（圖7g），與對照小鼠相比，LysM-Cre;BRD9fl/fl小鼠對LPS/結(jié)扎刺激的高炎癥反應的抵抗和RNAKL的增加可能緩解了急性局部骨損失，降低了破骨細胞活性。

為了測試dBRD9對LPS/結(jié)扎誘導的急性牙周炎和牙槽骨丟失的預防和治療潛力，作者進一步利用含有BRD9降解物的改性光固化SF，并在LPS/結(jié)扎誘導時將其注射到牙周組織中，對側(cè)含有SF的載體（圖7h），5 d后收集各組牙槽骨進行評估。結(jié)果顯示，與對照組相比，dBRD9組LPS/結(jié)扎刺激的牙周牙槽骨急性局部骨丟失（圖7i-k）、破骨細胞活性（圖7l，m）以及巨噬細胞激活和RANKL表達（圖7n，o）明顯減弱。這些結(jié)果表明，在感染刺激的情況下，骨組織中BRD9缺失或降解的抗炎作用可能比在基礎(chǔ)條件下更為突出。

圖7 BRD9缺失/降解物減輕脂多糖誘導的骨吸收

綜上，該研究確定了BRD9-FOXP1-STAT1軸，BRD9與轉(zhuǎn)錄因子FOXP1相互作用，激活STAT1轉(zhuǎn)錄和IFN-β信號轉(zhuǎn)導，這對維持破骨細胞負反饋循環(huán)和骨重塑的穩(wěn)態(tài)是不可或缺的。同時，作者設計了BRD9局部給藥系統(tǒng)，小鼠實驗結(jié)果顯示該給藥系統(tǒng)可有效減輕ZOL相關(guān)的ONJ和減輕脂多糖誘導的局部侵襲性牙周炎的急性骨質(zhì)流失。以上結(jié)果闡明了BRD9在破骨細胞中的功能及其對骨病的治療潛力，為未來開發(fā)破骨細胞相關(guān)骨病的治療策略提供了新的見解。