隨著二代測(cè)序的高速發(fā)展，越來越多的人類單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP,Single Nucleotide Polymorphisms）被證明與人類某些疾病密切相關(guān)，研究這些SNP相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制或治療方案，需要用到相應(yīng)的點(diǎn)突變細(xì)胞模型。然而點(diǎn)突變細(xì)胞構(gòu)建起來并不容易，選擇合適的方法，可以讓您事半功倍，到底有哪些方法呢？源井生物為您“揭秘”——

1. 最高效的方法——單堿基編輯器

原理描述：將表達(dá)gRNA、dCas9/nCas9和脫氨酶等質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，在不產(chǎn)生雙鏈斷裂的前提下，利用脫氨酶對(duì)gRNA靶向位點(diǎn)的單個(gè)堿基進(jìn)行替換，具有高效而又精確的基因編輯能力，可在動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)引入點(diǎn)突變，也可以對(duì)致病性點(diǎn)突變進(jìn)行糾正。其中，腺嘌呤單堿基編輯器（簡(jiǎn)稱ABE），可以對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)A→G/T→C的單堿基轉(zhuǎn)換，胞嘧啶單堿基編輯器（簡(jiǎn)稱CBE），可以對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C→T/G→A的單堿基轉(zhuǎn)換，目前主要采用BE3系統(tǒng)。

應(yīng)用場(chǎng)景：符合特定堿基變換，且能找到合適gRNA。突變糾正等疾病治療需求。

實(shí)驗(yàn)路線：

1）方案設(shè)計(jì)時(shí)，在點(diǎn)突變位點(diǎn)附近尋找gRNA，使得目標(biāo)突變點(diǎn)恰好處于單堿基編輯器的編輯窗口內(nèi)，且編輯窗口內(nèi)無其他同堿基非目標(biāo)突變。無需設(shè)計(jì)Donor。

2）通過質(zhì)粒（雙鏈DNA）作為載體將編輯系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞。

3）通常采用電轉(zhuǎn)或脂質(zhì)體的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4）無法僅通過PCR跑膠來篩選陽性克隆，一般需要測(cè)序比對(duì)。

優(yōu)點(diǎn)：編輯效率高，能精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)單堿基突變。不會(huì)造成DNA雙鏈斷裂，減少indel的發(fā)生。更安全，不易脫靶。

缺點(diǎn)：只能實(shí)現(xiàn)特定單堿基之間的轉(zhuǎn)換，無法滿足大部分科研需求。編輯窗口內(nèi)如果有其他同堿基非目標(biāo)靶點(diǎn)，也無法使用，應(yīng)用有較多限制。

2. 最主流的方法——RNP法

原理描述：將gRNA和Cas9蛋白在體外形成RNP復(fù)合物，再與單鏈Oligo共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，由RNP復(fù)合物對(duì)基因組靶點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別與切割，再以單鏈Oligo為模板進(jìn)行同源重組修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因點(diǎn)突變的目的。

實(shí)驗(yàn)路線：

1）方案設(shè)計(jì)時(shí)，需要在點(diǎn)突變上下游20個(gè)堿基內(nèi)找到特異性和切割效率高的gRNA，單鏈oligo模板長(zhǎng)度較短，設(shè)計(jì)120nt左右即可。

2）選擇sgRNA和Cas9蛋白作為載體。

3）通常采用電轉(zhuǎn)法或脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4）無法僅通過PCR跑膠來篩選陽性克隆，一般需要測(cè)序比對(duì)。

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優(yōu)點(diǎn)：適用性廣，編輯效率高，流程簡(jiǎn)單，項(xiàng)目周期短。

缺點(diǎn)：需要在點(diǎn)突變附近選擇gRNA，有一定的空間局限性；gRNA容易降解，對(duì)操作要求高。

3. 突破RNP法的局限——質(zhì)?？剐苑?/h1>

原理描述：使用gRNA和Cas9共表達(dá)的質(zhì)粒，與Donor質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Donor質(zhì)粒兩條同源臂中間構(gòu)建了一個(gè)兩端帶有l(wèi)oxp重組位點(diǎn)的抗性基因表達(dá)盒，目標(biāo)點(diǎn)突變則通過同源臂引入。轉(zhuǎn)染后通過加藥篩選，使沒有重組成功的細(xì)胞被殺死，提高陽性率，篩選到純合克隆后，再轉(zhuǎn)入一個(gè)表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒，將抗性基因刪除，完成模型制作。

應(yīng)用場(chǎng)景：適用部分RNP無法設(shè)計(jì)的點(diǎn)突變需求

實(shí)驗(yàn)路線：

1）通常在突變位點(diǎn)附近的內(nèi)含子處設(shè)計(jì)gRNA，以切割位置作為中心設(shè)計(jì)左右同源臂，同源臂一般較長(zhǎng)，約600-1000bp。

2）gRNA、Cas9和Donor都是質(zhì)粒（雙鏈DNA）作為載體。

3）通常采用電轉(zhuǎn)法或脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4）可以通過PCR跑膠進(jìn)行單克隆初篩，復(fù)檢再測(cè)序比對(duì)。

優(yōu)點(diǎn)：受突變點(diǎn)位置的限制較小，通過抗性篩選，可以提高陽性率。

缺點(diǎn)：流程復(fù)雜，周期長(zhǎng)?？剐曰騽h除后，內(nèi)含子處會(huì)有LoxP位點(diǎn)殘留。

4. 突破難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法——AAV-Donor法

原理描述：以AAV作為載體帶入Donor模板進(jìn)行同源修復(fù)，AAV基因組是游離的DNA單鏈，而且在細(xì)胞內(nèi)可以保留較長(zhǎng)時(shí)間，可以大幅提升同源重組效率。

應(yīng)用場(chǎng)景：難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，尤其是懸浮細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)路線：

1）通常在突變位點(diǎn)上下游50個(gè)堿基內(nèi)設(shè)計(jì)gRNA，以切割位置作為中心設(shè)計(jì)左右同源臂，同源臂一般較長(zhǎng)，約600-800bp。

2）Cas9通常以慢病毒的形式穩(wěn)轉(zhuǎn)，sgRNA和和Donor構(gòu)建在AAV載體骨架上。

3）通常采用AAV法進(jìn)行感染，慢病毒作為輔助。

4）通常不設(shè)計(jì)同時(shí)重組抗藥性，所以無法僅通過PCR跑膠來篩選陽性克隆，需要測(cè)序比對(duì)。

優(yōu)點(diǎn)：AAV為單鏈DNA病毒，能游離在細(xì)胞中作為模板，重組效率高。適用于懸浮細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。AAV在臨床應(yīng)用具有較高的安全性，所以在疾病療法方面，前景廣闊。

缺點(diǎn)：AAV病毒包裝時(shí)間較長(zhǎng)，費(fèi)用昂貴。對(duì)于血清型未知的細(xì)胞系，還需要測(cè)試血清型，周期較長(zhǎng)，費(fèi)用高。

? ? ? 總的來說，就是單堿基編輯器效率最高，流程簡(jiǎn)便，但是門檻也比較高，如果不符合單堿基編輯器的設(shè)計(jì)要求，通常情況選擇RNP法；如果RNP法在突變位置附近選不到合適的gRNA，就考慮質(zhì)粒抗性法擴(kuò)大gRNA選擇范圍。對(duì)于難轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞，還可以選擇AAV法來解決轉(zhuǎn)染問題和提高重組效率。

? ? ? 那么是不是選擇同一種系統(tǒng)，大家拿到點(diǎn)突變細(xì)胞的概率就一樣呢？其實(shí)不然，整個(gè)實(shí)驗(yàn)路線有很多細(xì)節(jié)可以優(yōu)化，比如在PAM結(jié)構(gòu)引入同義突變防止回切；在Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株基礎(chǔ)上構(gòu)建，提升轉(zhuǎn)染效率；或者調(diào)整同源臂長(zhǎng)度和GC含量、以及在轉(zhuǎn)染后加入抑制NHEJ修復(fù)路徑的試劑，提升同源重組效率等，這些環(huán)節(jié)優(yōu)化得好都可以提升點(diǎn)突變效率，具體就需要實(shí)驗(yàn)摸索和一定的經(jīng)驗(yàn)啦。

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Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株>>穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白，只需轉(zhuǎn)入gRNA和Donor即可實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變。

Cas9蛋白>>高純度，切割活性強(qiáng)，融合EGFP，可視化轉(zhuǎn)染效果，讓RNP法更簡(jiǎn)單。