背景

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性全身性自身免疫疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明，年齡、吸煙史、不良體質(zhì)指數(shù)(BMI)、免疫原性和基因多態(tài)性等多種因素都與RA的發(fā)病機(jī)制及其難治性有潛在關(guān)系。作為生命中不可避免的過程，衰老是各種疾病風(fēng)險(xiǎn)日益增加的一個(gè)主要因素。

代謝性DNA損傷和免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞衰老的重要生物學(xué)活動(dòng)。在衰老過程中，DNA片段會(huì)在血液中積累并進(jìn)入循環(huán)，成為循環(huán)自由DNA (cfDNA)。值得注意的是，DNA片段化也被認(rèn)為是許多疾病的生物學(xué)特征，如創(chuàng)傷、敗血癥、無菌性炎癥、心肌梗死、中風(fēng)、移植排斥反應(yīng)、糖尿病、鐮狀細(xì)胞病等。Aicardi-Goutières綜合征和家族性凍瘡狼瘡都有一個(gè)共同的表型特征——因不能及時(shí)清除self-DNA或self-RNA片段而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)被異常激活。經(jīng)緩解病情抗風(fēng)濕藥(DMARDs)治療后，RA患者血漿中的DNA片段化情況明顯降低，這說明DNA片段化可能與RA發(fā)病機(jī)制相關(guān)?；谥欣夏耆薘A發(fā)病率升高可能與年齡相關(guān)的DNA片段積累有關(guān)的假設(shè)，弄清這些患者血漿中DNA片段的來源、研究如何提高清除機(jī)制效率可能為RA的防治策略開辟新途徑。

為驗(yàn)證DNA片段是導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的因素之一，來自澳門科技大學(xué)創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)生物物理實(shí)驗(yàn)室、中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的Weidan Luo研究團(tuán)隊(duì)做了一系列的研究并在Research Square上發(fā)表了一篇題為：“Self-DNA accumulation as a risk factor for accelerating the pathogenesis of rheumatoid arthritis in elderly individuals”的文章。該文章稱DNA片段是炎癥釋放介質(zhì)的有效制造者，而TREX1基因是DNA片段的有效降解者，并提示TREX1是調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和衰老的關(guān)鍵基因。這一結(jié)論為我們提供了一個(gè)預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新思路，即快速清除體內(nèi)多余的DNA片段可確保衰老細(xì)胞保持健康。

3'->5' DNA外切酶TREX1在RA患者中顯著下調(diào)

為了研究DNA片段的積累是否會(huì)刺激異常的免疫反應(yīng)，作者首先測定了健康志愿者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者和骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者外周血標(biāo)本中TREX1 (DNA片段清除酶)和cGAS (DNA片段傳感器)的基因表達(dá)水平。圖1A 和圖1 B結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組和OA患者相比，RA患者TREX1基因表達(dá)水平明顯降低，而cGAS基因表達(dá)水平明顯升高，提示DNA片段積累與人類RA發(fā)病密切相關(guān)。圖1C表明，與年幼的對(duì)照大鼠(4周齡)相比，健康老年大鼠(>12月齡)的血液樣本中TREX1和cGAS的轉(zhuǎn)錄水平都很高。此外，TREX1的高表達(dá)能清除老年大鼠過量的DNA片段，可以防止異常的免疫反應(yīng)，維持動(dòng)物的健康狀態(tài)。

TREX1和cGAS信號(hào)通路在DNA片段誘導(dǎo)的促炎因子釋放中的作用

研究人員將DNA片段轉(zhuǎn)染到RA-FLSs?(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞)可刺激DNA片段清除酶TREX1和cGAS-STING的表達(dá)，并上調(diào)促炎細(xì)胞因子(TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-25 and IFN-β)表達(dá)，且都呈劑量依賴性(圖1D & E)。然而，TREX1、cGAS-STING和促炎因子的表達(dá)增長僅發(fā)生在轉(zhuǎn)染DNA片段后24小時(shí)內(nèi)，在轉(zhuǎn)染48至72小時(shí)后這些被激活的基因表達(dá)會(huì)下降。因此，作者推測，DNA片段誘導(dǎo)的TREX1上調(diào)可能有助于清除積累在細(xì)胞質(zhì)的DNA片段，降低cGAS-STING和促炎因子水平。

不僅如此，Western blot結(jié)果也證實(shí)：在RA-FLSs中引入DNA片段，TREX1和cGAS蛋白的表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性(圖2A)。為了揭示TREX1和cGAS-STING信號(hào)通路在DNA片段誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中的作用，在轉(zhuǎn)染DNA片段前，用siRNA沉默RA-FLSs中的TREX1和cGAS，并構(gòu)建了cGAS敲除RA-FLSs。如圖2B所示，沉默TREX1基因表達(dá)激活了cGAS-STING信號(hào)，進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)染了DNA片段的RA-FLSs中促炎性細(xì)胞因子的釋放，而敲除cGAS會(huì)顯著下調(diào)cGAS-STING信號(hào)、抑制DNA片段誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子釋放。這些結(jié)果證實(shí)DNA片段會(huì)激活炎癥反應(yīng)，且TREX1和cGAS均在DNA片段介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用。

敲除細(xì)胞目前已被廣泛應(yīng)用于疾病治療、信號(hào)通路、靶點(diǎn)驗(yàn)證的研究中。源井KO細(xì)胞現(xiàn)貨庫覆蓋上千種基因，滿足上述三大研究需求，超3000種現(xiàn)貨1周速遞，幫您大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，可以復(fù)制鏈接入庫搜索>>https://www.ubigene.com/ez_editor/?cate=16

關(guān)節(jié)注射DNA片段誘發(fā)TREX1條件敲除(TREX1Cre)大鼠關(guān)節(jié)炎

為闡明TREX1在AIA模型中DNA片段致病機(jī)制中的作用，作者通過CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組編輯，在SD大鼠中完成了Cre-loxP介導(dǎo)的TREX1條件敲除(TREX1Cre)，其中Cre腺相關(guān)病毒由源井生物提供。圖3A-C結(jié)果顯示在TREX1Cre/+?AIA大鼠和健康對(duì)照TREX1Cre/+大鼠后肢關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射200ug?DNA片段后，大鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重的后爪腫脹、紅斑和關(guān)節(jié)僵直。TREX1基因敲除或下調(diào)可能會(huì)增加對(duì)照組和后肢關(guān)節(jié)注射DNA片段的AIA大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，研究結(jié)果提示TREX1可能通過清除關(guān)節(jié)組織中的cfDNA對(duì)RA有良好的治療作用。

DNA片段可促進(jìn)TREX1Cre大鼠T細(xì)胞活化，減少Treg細(xì)胞數(shù)量

為檢測DNA片段對(duì)大鼠自身免疫反應(yīng)的影響，將超聲誘導(dǎo)的大鼠肌肉DNA片段經(jīng)尾靜脈注射至健康對(duì)照TREX1Cre/+大鼠和AIA模型TREX1Cre/+大鼠。與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，注射DNA片段的健康對(duì)照TREX1Cre/+大鼠和AIA模型TREX1Cre/+大鼠后肢關(guān)節(jié)腫脹越嚴(yán)重，關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯越高，骨破壞越嚴(yán)重。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，AIA TREX1Cre/?模型大鼠CD8+?T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少。靜脈注射DNA片段后，AIA模型TREX1Cre/+?(Cre H/L)大鼠和健康對(duì)照TREX1Cre/+ (Cre H/L)大鼠與健康對(duì)照TREX1野生型大鼠相比，CD8+?T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，Treg細(xì)胞數(shù)量減少。

腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的TREX1過表達(dá)抑制AIA大鼠滑膜炎癥

為進(jìn)一步研究TREX1在大鼠AIA發(fā)病機(jī)制中的作用，將表達(dá)TREX1的腺相關(guān)病毒(AAV-TREX1)注射到大鼠關(guān)節(jié)腔(2.5×1010?PFU或2.5×108?PFU)或尾靜脈(1.0×1011?PFU或1.0×109?PFU)，其中TREX1腺相關(guān)病毒由源井生物提供。注射AAV-EGFP的AIA大鼠(對(duì)照)后爪出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹、紅斑和關(guān)節(jié)僵直。AIA大鼠關(guān)節(jié)腔和尾靜脈注射AAV-TREX1后，關(guān)節(jié)炎評(píng)分和后爪體積均顯著降低，提示過表達(dá)TREX1的大鼠AIA的嚴(yán)重程度顯著降低，表明TREX1可能通過清除DNA片段在AIA大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中發(fā)揮抑制作用。

源井為該研究提供了Cre和TREX1腺相關(guān)病毒包裝服務(wù)，助力TREX1敲除大鼠構(gòu)建及TREX1過表達(dá)以驗(yàn)證TREX1在DNA片段介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用。除了腺相關(guān)病毒，源井還能提供慢病毒及腺病毒包裝服務(wù)，精研最優(yōu)質(zhì)粒配比，保障病毒活力強(qiáng)、滴度高，服務(wù)周期快至3周，可復(fù)制鏈接了解詳情！（https://www.ubigene.com/service/custom/12.html）

老化相關(guān)的細(xì)胞衰老和關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致c-Jun/c-?Fos轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)失衡和TREX1表達(dá)抑制

為了進(jìn)一步證明E2F1在TREX1表達(dá)中的作用，作者發(fā)現(xiàn)，E2F1在RA-FLSs中呈劑量依賴的過表達(dá)，TREX1和DP-1 (E2F轉(zhuǎn)錄因子的重要激活因子)的轉(zhuǎn)錄水平顯著且逐漸升高。與此同時(shí)，紫外線介導(dǎo)的DNA損傷和DNA片段直接攻擊誘導(dǎo)了E2F1、DP-1、c-Jun和c-Fos的表達(dá)，同時(shí)TREX1在RA-FLSs中以時(shí)間依賴性的方式上調(diào)。然而，E2F1 siRNA的存在顯著抑制了TREX1的高表達(dá)，表明E2F1是TREX1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。為了進(jìn)一步闡明TREX1在衰老和RA中的調(diào)控作用，作者測定了在轉(zhuǎn)染DNA片段的早期和晚期傳代的RA-FLSs中TREX1和AP-1復(fù)合物組分(c-Jun/c-Fos)的表達(dá)。無論DNA片段轉(zhuǎn)染成功與否，TREX1在晚期傳代RA-FLSs中表達(dá)量均顯著低于早期傳代RA-FLSs。siRNA敲降c-Fos顯著抑制DNA片段介導(dǎo)的TREX1在早期傳代RA-FLSs中的表達(dá)。無論是在老化相關(guān)的細(xì)胞衰老中，還是在關(guān)節(jié)炎條件下，通過抑制TREX1的轉(zhuǎn)錄因子，如E2F1和AP-1, TREX1的表達(dá)，都能促進(jìn)cfDNA的積累，從而激活自身免疫反應(yīng)。

綜上所述，該文章首次闡述了：①?DNA片段可能是誘發(fā)RA的潛在免疫原性因子?②TREX1的下調(diào)會(huì)促進(jìn)促炎因子的釋放，并可能參與RA患者DNA片段的積累，從而激活cGAS/STING信號(hào)通路進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。除此之外，該文章還將自身免疫組織炎癥與衰老聯(lián)系起來，將DNA片段的有效清除劃定為治療和預(yù)防RA和衰老相關(guān)疾病的重要策略。

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