散文網(wǎng) » 生活 »日常 » 謝天謝地！終于找到生信發(fā)文的套路捷徑了！3+，博士畢業(yè)夠了?。ǜ皆敿?xì)操作教程）

謝天謝地！終于找到生信發(fā)文的套路捷徑了！3+，博士畢業(yè)夠了?。ǜ皆敿?xì)操作教程）

2021-05-19 14:36 作者:酸談講科研 0人讀過 | 我要投稿

不用下載高通量數(shù)據(jù)、不學(xué)R，鼠標(biāo)“點點點“就能復(fù)現(xiàn)3分文章，輕松實現(xiàn)GEO多數(shù)據(jù)集合并分析，還有Cytoscape和CMAP數(shù)據(jù)庫操作教程，椅子已經(jīng)按不住了！

今天為大家?guī)硪黄?2019年12月發(fā)表于Adipocyte（IF：3.146）的純生信文章《Identification of biomarkers, pathways and potential therapeutic agents for white adipocyte insulin resistance using bioinformatics Analysis》，文章工作量不大，復(fù)現(xiàn)難度適中，5分鐘領(lǐng)悟文章思路，半小時完整復(fù)現(xiàn)，仔細(xì)看，文末有干貨呦~

?題目?

Identification of biomarkers, pathways and potential therapeutic agents for white adipocyte insulin resistance using bioinformatics Analysis

1.材料與方法

1）疾病：網(wǎng)膜白色脂肪組織胰島素抵抗、糖尿病及相關(guān)疾病

2）物種：人類

3）數(shù)據(jù)來源：GSE15773、GSE20950

4）測序類型：mRNA sequence

5）測序平臺： GPL570 (Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)

6）分組及樣本數(shù)：GSE20950：10 IRO vs 10 ISO；GSE15773：5 IRO vs 5 ISO

2.圖標(biāo)結(jié)果及復(fù)現(xiàn)

1.使用工具

1）仙桃學(xué)術(shù)生信工具（https://www.xiantao.love/products）

2）the Attie Lab Diabetes database (http://diabetes.wisc.edu)

3）The Connectivity Map (CMap) (https://portals.broadinstitute.org/cmap)

2.復(fù)現(xiàn)任務(wù)

Table1??IRO v.s ISO DEGs列表

Fig1 ?DEGs熱圖

Fig2??DEGs火山圖.

Fig3??GSEA富集分析IRO患者基因

Fig4?GO富集分析.DEGs

Fig5??KEGG富集分析DEGs

Fig6??顯著改變的DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)

Table2??Cytohubba.鑒定得到10個hub genes

Fig7??10周齡肥胖型糖尿病小鼠脂肪組織中hub基因表達(dá)顯著增加.

Table3??CMap預(yù)測可逆轉(zhuǎn)DEGs表達(dá)變化的top20小分子化合物

3.復(fù)現(xiàn)步驟

1.Table1 IRO v.s ISO DEGs列表
1）打開仙桃學(xué)術(shù)—生信工具（https://www.xiantao.love/），進(jìn)入“數(shù)據(jù)集檢索”模式，分別檢索GSE15773（選擇GSM395783-GSM395792共10例樣本添加至樣本庫）、GSE20950（選擇GSM523656-GSM523675共20例樣本添加至樣本庫）數(shù)據(jù)集

2）左側(cè)功能欄中進(jìn)入“我的樣本庫”，根據(jù)“Title“分組信息選擇15例Insulin resistant obese（IRO）為分組1，15例Insulin sensitive obese（ISO）為分組2，提交進(jìn)行差異分析

3）分析完成后下載結(jié)果報告

差異分析結(jié)果表格如圖，在Excel中按原文標(biāo)準(zhǔn)：|logFC|?>1, adj p?<0.05進(jìn)行篩選，保留：“Gene symbol, logFC, P.Value, Adj.P.Val, Discription”5列信息，將表格整理如下，最終得到107個差異基因（原文中得到86個差異基因）

將Excel表格復(fù)制到word中，整理為三線表格式，這樣就得到同款Table1啦~

2.Fig1 DEGs熱圖
1）進(jìn)入結(jié)果報告的網(wǎng)頁版，進(jìn)行“熱圖—細(xì)節(jié)修改”

2）聚類方式中選擇“行聚類”，將根據(jù)我們在樣本庫中設(shè)置的分組信息聚類顯示，確認(rèn)出圖后記得保存結(jié)果~

3.Fig2 DEGs火山圖
1）依然在結(jié)果報告的網(wǎng)頁版中選擇“火山圖—細(xì)節(jié)修改”

2）原文中為橫置火山圖，這里勾選“XY軸顛倒”即可實現(xiàn)，配色方案中修改第1、2個色塊，使高表達(dá)基因為為紅色，低表達(dá)基因為藍(lán)色；確認(rèn)出圖后保存結(jié)果

4.Fig3 GSEA富集分析IRO患者所有基因
1）進(jìn)入“數(shù)據(jù)集檢索”，因為只需要對IRO組基因進(jìn)行GSEA富集分析，我們可以在樣本庫中重新選擇分組，將15例IRO樣本中根據(jù)GSE不同分別添加至分組1、分組2，分析2項研究中IRO患者內(nèi)部的差異基因表達(dá)

2）完成后下載結(jié)果報告，打開“差異分析-自選樣本”，進(jìn)入“仙桃學(xué)術(shù)—生信分析工具”，進(jìn)行“GSEA分析”，查看教程文檔，將剛才結(jié)果報告中的表格按要求整理

3）提交進(jìn)行GSEA分析，下載結(jié)果Excel表格，篩選p.adj < 0.05 & q value < 0.25，依次降序、升序排列NES，得到正、負(fù)相關(guān)top3基因集

4）進(jìn)入“GSEA可視化”，原文分別展示了與IRO負(fù)、正相關(guān)性最高的top3基因集，我們這里也可以依次作圖；仙桃學(xué)術(shù)支持一次顯示5條富集通路的噢~

5）進(jìn)入仙桃學(xué)術(shù)—拼圖工具完成拼圖，下載TIFF或PDF文件即可~

5.Fig4 GO富集分析DEGs

1）接下來進(jìn)入“GO/KEGG富集分析”，查看教程文檔

2）打開最開始的IRO v.s ISO差異分析結(jié)果表格，按要求整理數(shù)據(jù)格式

在excel中進(jìn)行篩選根據(jù)原文中的“gene count > 2 & p < 0.05”，得到9564個結(jié)果，最后只保留id列，上傳數(shù)據(jù)進(jìn)行分析

3）可視化作圖中選擇“氣泡圖”，點的大小可以自由調(diào)節(jié)，最近新添加了“分面”選項，可以將GO條目中的BP、CC、MF區(qū)分顯示，確認(rèn)出圖后記得保存結(jié)果噢~

4）在“歷史記錄”中即可查找到我們保存的結(jié)果，可直接下載圖片

6.Fig5 KEGG富集分析DEGs
1）KEGG分析操作同GO富集分析，只需要在數(shù)據(jù)分析時左側(cè)的“條目“中選擇“KEGG”即可

2）KEGG可視化作圖同GO分析，一定要記得保存結(jié)果噢~

7.Fig6 顯著上調(diào)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)

1）接下來依然是DEGs分析，打開最開始的IRO v.s ISO差異分析結(jié)果表格，3.5中的篩選條件得到了9564個基因，數(shù)目較多；此處我們將篩選條件調(diào)整為“gene count > 2 & adj.P < 0.01”，得到3389個結(jié)果，降序排列l(wèi)ogFC，選擇top 100基因；進(jìn)入STRING官網(wǎng)（https://stringdb.org/cgi/network?taskId=bi95eWIlhuXf&sessionId=bJnie7b5bEon）

2）“Settings”中的 minimum required interaction score 默認(rèn)為0.4，與原文一致；查看Analysis，顯示得到59 nodes，103 edges，與原文中的47 nodes，102 edges十分接近

3）在Export中選擇圖片保存格式，順便直接將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行后續(xù)分析，得到PPI互作網(wǎng)絡(luò)“三維彈球圖”，所有的節(jié)點都可以自由拖動，大家也可像原文中合理安排一下布局~

4）Fig6b中使用Cytoscape的MCODE插件識別了顯著表達(dá)模塊，進(jìn)入Cytoscape，在MCODE插件中選擇識別全部網(wǎng)絡(luò)，新建網(wǎng)絡(luò)cluster，導(dǎo)出圖片即可；生信全書上篇中有老談老師對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的炒詳細(xì)介紹~

8.Table2 Cytohubba.鑒定得到10個hub genes
1）Cytoscape中的插件MCODE和Cytohubba都可以識別hub基因，其中Cytohubba中提供了10余種算法，算法之間沒有明顯的優(yōu)劣之分，選擇其中任一種均可，原文沒有詳細(xì)交代所使用的算法；當(dāng)然我們也可以將多種算法識別的hub基因取交集進(jìn)行下游分析。進(jìn)入Cytohubba模塊，使用默認(rèn)算法計算top10 hub基因

2）將識別的hub基因在word中整理為三線表格式就可以啦；當(dāng)然Cytohubba中的圖也可以導(dǎo)出為圖片放在文章中~

9.Fig7 10周肥胖型糖尿病小鼠脂肪中基因的表達(dá)明顯上調(diào)
1）接下來作者使用the Attie Lab Diabetes database 數(shù)據(jù)庫(收錄了可檢索的基因表達(dá)資源，顯示6種組織（胰島、脂肪組織、肝臟、比目魚肌、腓腸肌、下丘腦）中不同實驗組（4周/10周齡小鼠）基因表達(dá)譜，http://diabetes.wisc.edu)可視化了肥胖BTBR小鼠脂肪組織中hub基因的表達(dá)水平。進(jìn)入the Attie Lab Diabetes database數(shù)據(jù)庫，最上方導(dǎo)航欄選擇“Genomic Study of Parental Mice”

2）依次輸入CCL2、IL6、CCL4 3個hub基因查看數(shù)據(jù)庫中收錄的6種組織中目的基因表達(dá)水平。網(wǎng)站對y軸的3種單位做了介紹，Intensity2為探針原始強度，需謹(jǐn)慎用于比較；mlratio官方推薦用于同一細(xì)胞系內(nèi)年齡/肥胖比較，reratio推薦用于不同細(xì)胞系間比較；原文中比較了BTBR小鼠lean/ob，因此這里我們選擇第3幅—reratio組

3）將CCL2、IL6、CCL4三幅圖拼接，仙桃學(xué)術(shù)/PPT/AI均可完成~

10.Table3 CMap鑒定20種最重要的小分子化合物可逆轉(zhuǎn)DEGs在細(xì)胞系中的表達(dá)變化

1）最后作者使用CMAP數(shù)據(jù)庫（Connectivity map，由Todd Golub、Eric Lander等哈佛、劍橋、MIT等研究人員利用不同濃度小分子處理不同細(xì)胞株后得到基因表達(dá)譜，構(gòu)建的小分子藥物、基因表達(dá)與疾病關(guān)聯(lián)的生物應(yīng)用數(shù)據(jù)庫；將小分子與基因表達(dá)情況聯(lián)系起來。舊版網(wǎng)站已經(jīng)停止更新，上、下調(diào)基因之和可達(dá)1000；新版網(wǎng)站持續(xù)更新，上、下調(diào)基因分別不能超過150個）根據(jù)IRO/ISO組基因表達(dá)模式預(yù)測了可能有效干預(yù)IRO的20種小分子化合物；且數(shù)據(jù)庫上傳文件中基因名稱必須是HG-U133A芯片中基因?qū)?yīng)的探針I(yè)D。我們使用仙桃學(xué)術(shù)中的差異基因分析結(jié)果，根據(jù)adj.P、gene count及l(fā)ogFC分別篩選上調(diào)、下調(diào)top150基因，將gene symbol在NetAffx官方網(wǎng)站（https://www.affymetrix.com/Analysis/compare/index.affx）中進(jìn)行批量轉(zhuǎn)換

2）將轉(zhuǎn)換后的探針整理到Excel中，另存為txt格式，再將文件后綴命名為GPL196的.grp文件（GPL96探針格式），進(jìn)入CMAP官網(wǎng)（https://portals.broadinstitute.org/cmap/，舊版網(wǎng)站使用任意郵箱注冊即可使用，雖然網(wǎng)站仍可使用但目前已停止更新；新版網(wǎng)站https://clue.io/需教育郵箱注冊后方可使用，在舊版的基礎(chǔ)上增加了很多其他功能；其中query功能中上、下調(diào)基因數(shù)量限制在150），導(dǎo)航欄處選擇“query“，分別上傳上調(diào)、下調(diào)tag list進(jìn)行分析，命名分析結(jié)果