高 分 文 獻(xiàn) 解 讀

前列腺癌是全球男性最常見的癌癥之一。早期、低級(jí)別的癌癥可以通過手術(shù)或放射成功治療。對(duì)于患有前列腺以外的高級(jí)別腫瘤的患者，標(biāo)準(zhǔn)治療與雄激素治療相結(jié)合。雄激素消融阻斷前列腺腫瘤賴以生長和存活的男性激素，最初是有效的；然而，在沒有雄激素的情況下，前列腺癌會(huì)再次生長，并發(fā)展為更具侵襲性的形式，稱為去勢抵抗型前列腺癌（CRPC）?？谷萸傲邢侔┗颊卟豢杀苊獾貢?huì)對(duì)抗雄激素療法產(chǎn)生耐藥性，部分原因是雄激素受體（AR）突變或剪接變體能夠恢復(fù)AR信號(hào)。

上海奕拓生物和上海中國科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心朱繼東/朱光亞團(tuán)隊(duì)合作的研究顯示配體活化的AR可以形成轉(zhuǎn)錄活性的聚合物。AR的結(jié)構(gòu)化和非結(jié)構(gòu)化區(qū)域都有助于AR的有效相分離，無序N端起主要作用。AR液-液相分離行為具有轉(zhuǎn)錄活性和抗雄激素功效?？剐奂に乜梢砸耘潴w獨(dú)立的方式促進(jìn)AR抗性突變體的相分離和轉(zhuǎn)錄活性。該研究進(jìn)行了基于相分離的表型篩選，并鑒定了ET516分子，ET516特異性破壞AR聚合物，有效抑制AR轉(zhuǎn)錄活性，并抑制表達(dá)AR抗性突變體的前列腺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長。研究的結(jié)果表明液-液相分離是一種新的耐藥機(jī)制，并表明靶向相分離可能為藥物發(fā)現(xiàn)提供一種可行的途徑。

在這項(xiàng)研究中，來自于NanoTemper的微量熱泳動(dòng)MST互作技術(shù)以及nanoDSF蛋白穩(wěn)定性技術(shù)發(fā)揮了重要的作用。

蛋白與不同濃度的ET516（藍(lán)色）以及Enza（紅色）孵育進(jìn)行MST實(shí)驗(yàn)。mEGFP蛋白用作陰性對(duì)照（綠色）。使用親和力分析軟件擬合數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，ET516與NTD的親和力Kd值25μM，表明ET516可以作為很好的候選分子。

加熱過程從25℃增加到81.5℃，升溫速率為1℃/min。記錄發(fā)射強(qiáng)度比（Em350nm\/Em330nm），分析熒光強(qiáng)度比（左圖）和一階導(dǎo)數(shù)（右圖）。

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監(jiān)測蛋白內(nèi)源熒光的nanoDSF實(shí)驗(yàn)顯示，ET516處理后AR AF-1中的熒光比率呈劑量依賴性下降，進(jìn)一步證實(shí)了ET516和AF-1的相互作用。熱位移TSA結(jié)果表明，AF-1是典型的固有無序蛋白，其在加熱過程中沒有明顯的發(fā)射強(qiáng)度變化；然而，與ET516孵育誘導(dǎo)了AF-1熔化溫度的劑量依賴性變化，表現(xiàn)為球狀蛋白，表明ET516與重新分布后穩(wěn)定的構(gòu)象AF-1結(jié)合。Promethus系列儀器通過內(nèi)源熒光檢測，無需加入染料，對(duì)緩沖液沒有要求，高精準(zhǔn)的檢測精度可以保證即使是極小結(jié)構(gòu)變化造成的Tm值shift都可以很好表征。

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對(duì)于固有無序蛋白，因?yàn)槠涞鞍椎臒o序性的特性，其他常規(guī)方法難以進(jìn)行檢測。在這篇工作中，通過MST技術(shù)及nanoDSF技術(shù)，很好的篩選到目的分子。

Monolith系列分子互作儀基于MST技術(shù)，不依賴于分子量的改變，蛋白用量少，對(duì)于蛋白聚集耐受度高，可以輕松表征不同類型的分子間相互作用。

Promethus系列儀器，以nanoDSF技術(shù)為核心，通過檢測蛋白內(nèi)源熒光監(jiān)測蛋白的穩(wěn)定性，該技術(shù)檢測蛋白濃度寬泛，低濃度也可輕松表征，媲美DSC的高精準(zhǔn)檢測結(jié)果，快速高通量的檢測速度，在小分子篩選上具有不可比擬的優(yōu)勢。

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