一.我在做一個(gè)模擬胃內(nèi)容物中藥物反應(yīng)試驗(yàn)，需要動態(tài)測定某藥品含量變化。分析時(shí)碰到一個(gè)棘手問題，進(jìn)樣量同樣用20ul，用對照品進(jìn)樣時(shí)色譜峰形不錯(cuò)，進(jìn)樣品時(shí)卻一直不能得到好的峰形。后來分析是模擬胃內(nèi)容物樣品的酸度過高的因素，可我通過稀釋的方法讓樣品酸度和流動相接近，雖然峰形沒問題了，卻發(fā)現(xiàn)因稀釋導(dǎo)致分析物在樣品中含量下降，低于最低檢測限了，如何是好呢？

? ? ? ?答：稀釋很方便，但靈敏度更高的檢測器不容易找，不過還是有個(gè)簡單的解決方案。當(dāng)用流動相稀釋樣品時(shí)，只要稀釋后樣品中有機(jī)相含量比流動相中的有機(jī)相比例低10個(gè)百分點(diǎn)以上（如流動相中甲醇含量是40%，則樣品中甲醇含量一定要低于30%），樣品流動會被色譜柱進(jìn)口端延緩或阻擋，稱為“柱上富集”。由于“柱上富集”作用的存在，這種情況下進(jìn)行大體積樣品進(jìn)樣，可避免樣品溶劑組成和流動相一樣時(shí)進(jìn)樣量過大產(chǎn)生的“峰展寬”。針對你提的這個(gè)實(shí)例，可用稀的NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品pH和流動相匹配，并將樣品最終稀釋一倍。將進(jìn)樣量提高一倍到40ul，就可達(dá)到最低檢測限的要求。

二.峰形后拖尾是什么原因造成的？

? ? ? ?答：柱物理損壞：色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。唯一的解決方法就是更換新柱。

? ? ? ?柱內(nèi)填料污染：流動相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。流動相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純試劑。流動相所用的水最好是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45um溶劑微孔過濾（器）過濾，除去可能存在的微粒。流動相建議現(xiàn)用現(xiàn)配，對于含鹽的溶液尤其注意長置會產(chǎn)生細(xì)菌或出現(xiàn)沉淀。此外還得保證儲存流動相的容器清潔。

? ? ? ?復(fù)雜樣品可選用0.45um溶劑微孔過濾（器）或樣品預(yù)處理柱對樣品進(jìn)行預(yù)處理，確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。柱內(nèi)填料污染時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復(fù)?；蛞阅苋芙馕廴疚锏牧鲃酉喟瓷V柱使用的相反方向，沖洗色譜柱（約20至30倍柱體積，或視具體情況而定；另外，此時(shí)不能接檢測器），將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標(biāo)明的使用方向使用。

? ? ? ?柱進(jìn)口處有異物：當(dāng)斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內(nèi)即可。

? ? ? ?樣品濃度過高致使柱超載：樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾（或伸舌）。適當(dāng)減小進(jìn)樣量或樣品濃度（需要時(shí)，可提高檢測器靈敏度）直至峰形和保留時(shí)間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3～50ug范圍內(nèi)，不會引起明顯超載。

? ? ? ?柱溶液濃度不對：選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾。最好選用流動相溶解樣品。

? ? ? ?柱外效應(yīng)：柱外效應(yīng)（即進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測器間的管路過長、直徑過粗、管路接頭不匹配、有死體積）是影響色譜柱柱效的主要因素之一。所以在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內(nèi)徑盡可能細(xì)小，切口務(wù)必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴(kuò)散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。

? ? ? ?緩沖不足或不合適：在緩沖不好或離子強(qiáng)度過低的分離中，也會出現(xiàn)保留時(shí)間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度（與樣品大小相匹配）能改善此情況。

? ? ? ?硅醇基團(tuán)作用：仔細(xì)分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團(tuán)。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團(tuán)或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機(jī)理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。為了減小峰形拖尾，通常可在流動相加入25mM三乙胺（抑制劑）。三乙胺能與硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團(tuán)的作用，以保證保留機(jī)理正常進(jìn)行，并大大緩解了峰形拖尾建議使用長鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但持續(xù)力較三乙胺長。因?yàn)橐种苿┓肿又谐税坊c硅醇基團(tuán)發(fā)生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果將抑制劑加至樣品中，效果會顯著。

? ? ? ?柱內(nèi)金屬污染：柱內(nèi)金屬污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn)，也可由腐蝕性流動相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片，隨流動相沉積到柱填料中。例如C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對稱的。

三.流動相與柱子如何才能做到匹配，達(dá)到最好的分離效果。目前我們實(shí)驗(yàn)室有購買好的色譜柱，可是對樣品的分離效果不是很好。

? ? ? ?答：不同填料的色譜柱都有自己的選擇性，相同填料不同廠家以及相同廠家不同品牌之間的選擇性都是不一樣的，一般情況下根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)將分離的大方向如：正相分析或者反相分析，確定后，一般可以根據(jù)調(diào)節(jié)色譜條件能得到好的色譜峰形，這方面的資料論壇當(dāng)中很多，但是也有些色譜柱不管怎么調(diào)整色譜條件都不行，表面這款色譜柱的選擇性不適合該樣品的選擇。

四.我用的是C18柱，后面黑色的是我以前跑的圖，前面是我現(xiàn)在跑的圖形，完全一樣的東西，只是流動相不是一批配的（流動相的成分沒變），中間柱子別人用過了，峰型怎么發(fā)生了這么大的變化??？可能的原因是什么啊？是不是柱子出了問題?。?/p>

? ? ? ?答：從兩個(gè)圖對比很明顯可以看出是柱效嚴(yán)重下降，且伴有肩峰。不同時(shí)間配的流動相，如果成分和pH沒變的話，肯定不會造成這個(gè)結(jié)果。估計(jì)是別人用柱子過程中，造成了柱頭塌陷、柱頭污染以及固定相流失等嚴(yán)重問題，如樣品太臟，流動相或樣品pH太高或太低，都會造成這個(gè)結(jié)果。

? ? ? ?你可以試著用色譜柱清洗和再生的方法反沖維護(hù)一下，但不能保證一定能回到原來的效果。再生如果不行，考慮挖補(bǔ)柱頭填料，實(shí)在不行，柱子也只能報(bào)廢。建議柱子最好還是專門用于一種方法比較好，像你這種情況，都搞不清別人怎么用柱子的，分析解決問題就相當(dāng)難。

五.柱子的柱效影響大嗎？一般柱子的柱效規(guī)定是多少的呀！理論塔板數(shù)一般要達(dá)到多少呢？主要有那些因素影響它。

? ? ? ?答：柱效是柱子性能好壞的一個(gè)重要體現(xiàn)指標(biāo)。柱效會影響分離度，當(dāng)然是峰形越尖銳，柱效越高，和其它峰越容易分開。另外柱效高峰形尖銳，對峰面積的積分誤差就小，甚至可以用峰高來定量。

? ? ? ?一般C18柱，在測定甲苯等不易拖尾的小分子中性不電離物質(zhì)時(shí)，5um的填料，每米的柱效能達(dá)到80000以上的塔板數(shù)，就算合格吧。在實(shí)際分析物的測定時(shí)，一般藥典有規(guī)定最低柱效是2000-3000，一般新柱子的柱效都高于這個(gè)數(shù)。但柱子在使用后，由于固定相流失等原因，柱效會逐步下降，當(dāng)下降到不符合藥典最低柱效要求，或者導(dǎo)致分離度不夠時(shí)，色譜柱就算壽命到了。單從柱效逐步下降這個(gè)角度看，柱效高的色譜柱相對使用壽命更長。

? ? ? ?影響柱效的因素有粒徑、粒徑和孔徑分布、固定相鍵合密度、柱外體積和溫度等，柱子裝填緊密、柱床均勻一致也對提高柱效有好處。這些影響因素中，很多是和生產(chǎn)廠商有關(guān)，你這邊能做的是盡量減少柱外連接體積。

總結(jié)

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