CRISPR是一種革命性的基因組編輯技術，是一項有可能會改變世界的技術。雖然這還是一個相對較新的發(fā)現(xiàn)，但很快，CRISPR將成為用于生物學研究標準的實驗工具。CRISPR最廣泛應用之一是敲除特定基因以了解該基因的功能。實驗通常需要同時轉(zhuǎn)染大量細胞，形成具有不同Indel的基因編輯細胞混合克隆，也被稱為KO（敲除）pool。CRISPR介導產(chǎn)生的KO pool取代了較傳統(tǒng)的基于RNAi的方法，正逐漸成為許多研究細胞系基因功能的研究人員的首選方法。KO pool混合了野生型和編輯過的細胞，敲除效率可能會隨時間而變化。但是，對于短期測定來說，KO pool是非常有用的。

應用：

具有高敲除效率的KO pool適合直接用于許多類型的測定，而不需要額外挑取單克隆細胞來進行測定，因為基因型畸變可以直接影響到表型狀態(tài)。因此，KO pool在以下研究領域具有廣泛的應用：

1.?增殖測定

2.?基因發(fā)現(xiàn)：識別新的癌癥驅(qū)動基因并發(fā)現(xiàn)癌癥特異性脆弱性。

3.?藥物反應/藥物靶標識別

4.?疾病模型發(fā)展

5.?抗體驗證（免疫印跡/免疫熒光）

CRISPR-U? 基因編輯KO pool

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種有效的基因組編輯系統(tǒng)，通過用gRNA和所需的donor序列打靶和取代靶基因序列，進行基因敲除或敲入的基因組編輯操作。通過CRISPR技術制作KO pool，可節(jié)省單克隆化而花費的時間和成本。如今，科學家開始從RNAi轉(zhuǎn)移到使用KO pool進行基因的早期探索性研究，因為KO pool降低了進入的成本，并且與RNAi非常相似。此外，CRISPR技術可以產(chǎn)生穩(wěn)定的蛋白質(zhì)功能敲除，可以提供比RNAi更徹底的結果。具有更高效率的KO pool對于藥物靶標，藥物反應，抗體驗證，疾病模型開發(fā)以及各種功能測定的研究來說非常有用。為了加快生物醫(yī)學研究的發(fā)展，源井生物開發(fā)了CRISPR-U?系統(tǒng)，應用于快速而精確的細胞基因編輯。此外，CRISPR產(chǎn)生的KO pool可以與功能喪失測定，高通量篩選，抗體驗證和安全藥理學研究相結合。源井生物可以定制基因編輯敲除細胞系和KO pool。

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運用：

KO pool可用于研究表達量過低或不可檢測的靶蛋白基因

基于CRISPR/Cas9的基因敲除（KO）能夠精確擾亂靶基因的功能，并且在理想情況下，通過人類細胞中的分子組學讀數(shù)將以無偏差的方式分析這些現(xiàn)象。一般來說，這需要一個分離KO單克隆的漫長過程。在這項研究中，研究人員使用了一種策略，避免了進行單克隆分選，并通過使用在基因組上打靶接近序列（40-300 bp）的兩個gRNAs的協(xié)同組合，在KO pool上實現(xiàn)了快速而有效的基因沉默。研究人員在HepG2細胞中敲除吡哆醛激酶（PDXK）并生成PDXK-KO pool。同時，研究人員還制備PDXK-KO單克隆來進行比較。他們比較了KO單克隆和KO pool中產(chǎn)生的表型蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)。

重復實驗之間的標準差顯示了KO pool的數(shù)據(jù)集比三個PDXK-KO單克隆數(shù)據(jù)集顯示出更小的變化（見圖1A）。無偏差全蛋白質(zhì)組分析在HepG2 KO pool中鑒定出了6種顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)，而在KO克隆中，只鑒定出4種顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)。我們需要用MS定量對同源蛋白的殘留水平進行檢測，以排除該截短蛋白在早期終止密碼子或外顯子跳躍后仍表達，而這可能會擾亂KO表型的分析和解釋。

因此，基因敲除（KO）pool同樣能夠精確地干擾靶基因功能，可通過分子組學讀數(shù)評估基因敲降以及分析KO表型。使用KO pool，可能是比RNAi更好的研究基因功能的方法。

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Reference::

A Tandem Guide RNA-Based Strategy for Efficient CRISPR Gene Editing of Cell Populations with Low Heterogeneity of Edited Alleles. CRISPR J.2020;3(2):123-134.