細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染可以依據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細(xì)胞的時間長短分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

一、區(qū)別及特點在于

首先瞬時轉(zhuǎn)染：

1、導(dǎo)入的DNA沒有整合到基因組中，而是保留在細(xì)胞核上

2、導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)不傳遞到子代，遺傳改變是暫時的

3、不需要選擇性篩選

4、DNA載體和RNA都可用于瞬時轉(zhuǎn)染

5、導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)的高拷貝數(shù)導(dǎo)致高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)

6、通常在轉(zhuǎn)染后24-96小時內(nèi)收獲細(xì)胞

7、通常不適合使用具有誘導(dǎo)型啟動子的載體研究

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其二穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：

1、導(dǎo)入的DNA整合到了基因組中

2、導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)能夠代代相傳。遺傳改變是永久的

3、需要選擇性篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

4、只有DNA載體可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，RNA本身不能穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞中

5、單拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的穩(wěn)定整合的DNA導(dǎo)致較低水平的蛋白質(zhì)表達(dá)

6、需要2-3周的時間篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆

7、適用于使用帶有誘導(dǎo)型啟動子的載體研究

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二、轉(zhuǎn)染方法

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為三大類：化學(xué)法、物理法及生物學(xué)法。

1、化學(xué)法

①磷酸鈣法

原理：磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞

應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；瞬時轉(zhuǎn)染

特點：不適用于原代細(xì)胞，操作簡便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用，pH敏感

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②陽離子脂質(zhì)體法

原理：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞

應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；瞬時轉(zhuǎn)染

特點：適用性廣，可用于DNA和RNA片段，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大

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③DEAE-右旋糖苷法

原理：帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞

應(yīng)用：瞬時轉(zhuǎn)染

特點：相對便捷、結(jié)果可重復(fù)，但對細(xì)胞有一定的毒副作用（微毒性），轉(zhuǎn)染時需除血清

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④病毒介導(dǎo)法

原理：通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中

應(yīng)用：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

特點：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等

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⑤逆轉(zhuǎn)錄病毒

原理：介導(dǎo)外源基因以逆轉(zhuǎn)錄方式整合進(jìn)目的細(xì)胞基因組

應(yīng)用：特定宿主

特點：攜帶基因不太大的細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素

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⑥腺病毒

原理：通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中

應(yīng)用：瞬時轉(zhuǎn)染；特定宿主

特點：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮安全因素

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⑦Biolistic顆粒傳遞法

原理：將DNA用顯微鏡重金屬顆粒沉淀，再將抱被好的顆粒用彈道裝置投射入洗吧，DNA在胞內(nèi)逐步釋放表達(dá)

應(yīng)用：瞬時轉(zhuǎn)染

特點：可用于人的表皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系及原代細(xì)胞

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⑧電穿孔法

原理：高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入

應(yīng)用：瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、所有細(xì)胞

特點：適用性廣但其細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大

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⑨顯微注射法

原理：用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核

應(yīng)用：瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

特點：轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細(xì)胞

三、影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染的因素

1.如果是貼壁生長細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必須用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70-90%（貼壁細(xì)胞）或2×106-4×106細(xì)胞/ml（懸浮細(xì)胞）為宜，最好在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。

2.用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì)，無RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。

3.有血清時的轉(zhuǎn)染：

1）在開始準(zhǔn)備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基，因為血清會影響復(fù)合物的形成。（但其實只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不含血清，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。）

2）陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時需要對條件進(jìn)行優(yōu)化。

3）大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用OPTI_MEM培養(yǎng)基，一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基。

4.培養(yǎng)基中的抗生素

抗生素是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，在理論上抗生素也進(jìn)不到細(xì)胞內(nèi)，但陽離子脂質(zhì)體試劑一定程度上增加了細(xì)胞的通透性，使其能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。這大大降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。

對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是基因蛋白選擇性抗生素（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑）的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基細(xì)胞的健康生長，需使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

5.設(shè)置陽性對照和陰性對照。

6.一般在轉(zhuǎn)染24-48h，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測實驗。

7.如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，則可對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等。