?細胞轉(zhuǎn)染

①轉(zhuǎn)染前進行細胞準備，在顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，細胞密度在80%時，消化細胞。根據(jù)實驗需要接種細胞，以24孔板為例，在每個細胞孔中接種 3×105個細胞，培養(yǎng)至細胞密度為50%～60%，即可進行轉(zhuǎn)染。

②在超凈工作臺中放入完全培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000、siRNA儲存液、miRNA inhibitor、miRNA mimic等，紫外照射30 min。取2只1.5 ml無酶無菌EP管，標記為A、B管，以向24孔板的一孔轉(zhuǎn)染siRNA為例。因為siRNA配置好后，要經(jīng)過Lipofectamine 3000的包裹，才能被瞬時轉(zhuǎn)染進細胞中，因此該操作一定要細致。向A、B管中各加入25 ul的Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，一定要先加培養(yǎng)基。向A管中加入1.5 ul的?Lipofectamine 3000，再根據(jù)預先設計好的體系，注意滴加液體時緩慢輕柔，以免siRNA斷裂，降低轉(zhuǎn)染效率，向B管中加入2.5 ul的siRNA儲存液。將B管液體轉(zhuǎn)移至A管，注意輕柔緩慢滴加，上下顛倒，輕柔混勻，室溫靜置15 min，等待Lipofectamine 3000包裹siRNA。（siRNA和lipo3000的配比需要自己摸索）

③在此期間將24孔板從細胞培養(yǎng)箱取出，棄去培養(yǎng)基，向每孔中加入950 ul完全培養(yǎng)基（轉(zhuǎn)染體系的補充用10%血清的完全培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基等需要自己摸索）。待轉(zhuǎn)染液靜置15?min后，向每孔中緩慢輕柔滴加50 ul轉(zhuǎn)染液，輕柔搖晃細胞板混勻液體，標注轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染體系、轉(zhuǎn)染試劑名稱等基本信息，放入37℃細胞培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染24小時后在顯微鏡下觀察細胞生長狀況，并更換培養(yǎng)基。（具體更換培養(yǎng)基的時間需要自己摸索）

④轉(zhuǎn)染48小時后提取細胞總RNA，但不同的轉(zhuǎn)染試劑效果不一致，細胞中RNA水平表達的時間不一致，根據(jù)具體情況確定，再進行qRT-PCR實驗檢測表達情況，計算siRNA轉(zhuǎn)染后敲減效率，選擇敲減效率高的siRNA進行后續(xù)實驗。根據(jù)實驗需要，確定后續(xù)實驗的時間。如果下一步將進行蛋白免疫印跡法（Western Blot）、流式細胞術(shù)，則需要在轉(zhuǎn)染后72小時進行。如果下一步將進行集落形成實驗，則需要在轉(zhuǎn)染后48小時進行。如果下一步安排transwell遷移和侵襲實驗，則需要在轉(zhuǎn)染后36小時到72小時內(nèi)進行。如果下一步將進行傷痕劃痕實驗，則需要在轉(zhuǎn)染后24小時到72小時內(nèi)進行。

所有實驗方法的時間、試劑配比需要根據(jù)自己的實驗條件和目的以及細胞狀態(tài)等自行摸索，本實驗方法僅供參考。

本人保留一切權(quán)利，以上實驗步驟僅供參考。?