基因敲除?NCI-H1299細(xì)胞系

NCI-H1299細(xì)胞系，也稱為H1299或CRL-5803，是衍生自淋巴結(jié)的人類非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系與其他永生細(xì)胞系相似，H1299細(xì)胞可以無限分裂。另外，H1299細(xì)胞具有TP53基因的純合部分缺失，因此它們不表達(dá)會導(dǎo)致其增殖傾向的抑癌p53蛋白。此外，據(jù)報道，這些細(xì)胞可以分泌肽激素神經(jīng)調(diào)節(jié)素B（NMB），但不能分泌胃泌素釋放肽（GRP）。具有這些有趣的特征，NCI-H1299細(xì)胞成為涉及基因敲除，基因敲入和點突變的生物學(xué)領(lǐng)域的流行基因敲除細(xì)胞系。

肺癌是全世界男性和女性中第二大最普遍，最致命的惡性腫瘤。另一方面，NSCLC約占肺癌的85％，這是全球癌癥死亡的主要原因。由于H1299細(xì)胞系來源于淋巴結(jié)，因此這些細(xì)胞已被廣泛用于肺癌研究。表征癌細(xì)胞中累積的遺傳改變對理解腫瘤生物學(xué)和指導(dǎo)藥物設(shè)計都具有重要意義。此外，它可能通過基因定制的癌癥相關(guān)細(xì)胞，例如基因敲除的H1299細(xì)胞等，使有針對性癌癥治療的患者受益。研究表明，NCI-H1299細(xì)胞系是一種穩(wěn)定的細(xì)胞系，具有純合子敲除的功能。一些人類基因使用CRISPR-Cas9。因此，NCI-H1299的基因敲除技術(shù)通常用于治療肺癌。

應(yīng)用：

紫杉醇降低了Rsf-1基因敲除NCI-H1299的遷移和增殖能力

?紫杉醇是治療肺癌的經(jīng)典藥物，但很容易引起耐藥性。因此，迫切需要克服耐藥性的新方法。 Rsf-1表達(dá)在肺癌中較高，并通過NF-κB途徑提高紫杉醇的耐受性。許多其他基因也與藥物抗性有關(guān)，例如影響凋亡和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系周期的基因。

Chen及其同事使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了肺癌細(xì)胞和異種移植小鼠中的Rsf-1，并通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑的激活及其下游表達(dá)來測試Rsf-1是否影響肺癌對紫杉醇的敏感性?；颉＝Y(jié)果表明紫杉醇降低了Rsf-1-基因敲除的NCI-H1299和NCI-H460細(xì)胞遷移和增殖的能力，并增加了細(xì)胞凋亡。在患有源自Rsf-1基因敲除細(xì)胞的異種移植腫瘤的小鼠中，紫杉醇的抗腫瘤作用增強(qiáng)。因此，通過CRISPR-Cas9技術(shù)靶向Rsf-1也已成為治療肺癌的方法之一。

敲低PON2基因以研究NCI-H1299細(xì)胞系增殖

?先前的研究表明，與相應(yīng)的相鄰非腫瘤組織相比，NSCLC患者的癌組織中對氧合酶2（PON2）（一種具有抗氧化特性的內(nèi)酯酶/芳基酯酶）的表達(dá)明顯增強(qiáng)。此外，增加的PON2表達(dá)可能有助于NSCLC細(xì)胞對經(jīng)典的抗NSCLC治療藥物產(chǎn)生抗藥性。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)，通過siRNA穩(wěn)定降低PON2的表達(dá)可以減少NSCLC細(xì)胞（如NCI-H1299細(xì)胞）的增殖。

?為了進(jìn)一步闡明PON2在NSCLC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建增殖中的作用，在NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299中應(yīng)用了兩個基因編輯系統(tǒng)TALEN和CRISPR / Cas。結(jié)果表明，Cas9表達(dá)是由外源性強(qiáng)力霉素以可逆方式誘導(dǎo)的，為研究基因表達(dá)的變化如何調(diào)控NSCLC細(xì)胞株增殖提供了一個平臺。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對GLUL基因組位點進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生產(chǎn)生產(chǎn)生EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)需求，源井生物結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計

?方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

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Reference:

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Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362 .

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