試用！BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶
產(chǎn)品名稱：BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶
供應(yīng)商：上海生物網(wǎng)
貨號：FA000002218
規(guī)格：2000U
BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶是一種高效的反轉(zhuǎn)錄酶，其全稱為BeyoRT? II Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase。它是從Moloney Murine Leukemia Virus（莫爾尼小鼠白血病病毒）中提取和純化的酶。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶是一種RNA依賴性DNA聚合酶，可以將RNA模板轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的DNA。
BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。它在合成cDNA（亦稱為反轉(zhuǎn)錄）過程中起到關(guān)鍵的作用。通過該酶，可以將RNA模板中的信息轉(zhuǎn)錄成cDNA，從而方便后續(xù)的基因表達(dá)研究、基因克隆、基因測序等。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶在反轉(zhuǎn)錄過程中具有高度的逆轉(zhuǎn)錄活性和模板特異性，能夠在相對較寬的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶具有以下特點(diǎn)：
1. 高逆轉(zhuǎn)錄活性：能夠高效地將RNA模板轉(zhuǎn)錄成cDNA。
2. 溫度適應(yīng)性：在一定范圍內(nèi)具有較好的活性和穩(wěn)定性，使其適用于多種反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)條件。
3. 模板特異性：對RNA模板具有較高的特異性，能夠選擇性地合成cDNA。
4. 反應(yīng)條件靈活性：適用于各種反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)條件，可進(jìn)行熱啟動(dòng)反應(yīng)或常規(guī)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
使用BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)反轉(zhuǎn)錄總RNA后，對于不同長度的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳效果如下。圖中可見對于0.2-8kb的cDNA可以非常高效地被反轉(zhuǎn)錄。
總之，BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶是一種常用的反轉(zhuǎn)錄酶，用于將RNA模板轉(zhuǎn)錄成cDNA，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究、基因克隆、基因測序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。
使用BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以按照以下步驟進(jìn)行操作：
1. 準(zhǔn)備反應(yīng)混合液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和所需反應(yīng)體系，將以下試劑混合在無核酸酶的條件下：
- RNA模板：待轉(zhuǎn)錄的RNA樣本。
- 引物：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的引物，可以是隨機(jī)引物或特異引物。
- dNTP混合物：包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。
- 反轉(zhuǎn)錄緩沖液：包含MgCl2和其他反應(yīng)所需的緩沖鹽和酶抑制劑。
- RNase抑制劑：用于保護(hù)RNA模板免受RNase的降解。
- BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶：根據(jù)反應(yīng)體系確定所需的酶量。
2. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將準(zhǔn)備好的反應(yīng)混合液加入反應(yīng)管中，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕靹?。根?jù)實(shí)驗(yàn)需要，可以選擇在常規(guī)溫度下進(jìn)行反應(yīng)或進(jìn)行熱啟動(dòng)反應(yīng)。
3. 反應(yīng)條件：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和反轉(zhuǎn)錄酶的建議條件，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r(shí)間進(jìn)行反應(yīng)。通常反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42-55°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間可以根據(jù)所需的cDNA合成長度和RNA模板的豐度來確定。
4. 反應(yīng)終止：反應(yīng)結(jié)束后，可以通過加熱或加入抑制劑等方法停止反應(yīng)。加熱可以在70-75°C下進(jìn)行5-10分鐘，以使反轉(zhuǎn)錄酶失活。
BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)在不同溫度下的反轉(zhuǎn)錄效果。用從NIH3T3細(xì)胞抽提獲得的總RNA 500 ng，在20μl的反轉(zhuǎn)錄體系中按照下圖中所示溫度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄完成后取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增和電泳。
需要注意以下幾點(diǎn)：
- 實(shí)驗(yàn)操作：在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前，要確保操作環(huán)境和儀器器材的無RNase污染。使用無核酸酶的試劑和設(shè)備，并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。
- RNase抑制劑：向反應(yīng)體系中添加RNase抑制劑，可以有效地保護(hù)RNA模板免受RNase降解。確保RNase抑制劑的濃度足夠高以提供保護(hù)。
- 溫度和時(shí)間：選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度和時(shí)間，以確保反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效果。溫度過高或時(shí)間過長可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增或降解。
- 正、反控制：在實(shí)驗(yàn)中包含正、反控制樣本，以確保反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的準(zhǔn)確性。正控制樣本是已知含有特定RNA的樣本，反控制樣本是不添加RNA模板的反應(yīng)體系。
總之，在使用BeyoRT? II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)，要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，確保無RNase污染，選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，并包含正、反控制樣本進(jìn)行驗(yàn)證，以獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
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