CCK-8試劑盒簡介Cell Counting Kit 簡稱 CCK-8 試劑盒，是一種基于 WST-8 （化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測定 OD 值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。CCK-8 目前已廣泛應(yīng)用于高通量藥物篩選，細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。

基本操作方法1. 使用96孔板，每孔加入100-200 μL培養(yǎng)基，含1000-2000個細(xì)胞，該細(xì)胞數(shù)目需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定。接種的孔數(shù)根據(jù)具體實驗要求設(shè)定。

2. 為了降低邊緣效應(yīng)對孔內(nèi)細(xì)胞的不良影響，則實驗孔周邊各孔，用250?μL PBS補(bǔ)足，并放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至所需的天數(shù)。

3. 實驗前將CCK-8取至室溫平衡溶解，再按照CCK-8溶液：培養(yǎng)基=1:10的比例，配制適量的含CCK-8的完全培養(yǎng)基。此過程需避光，配制后的培養(yǎng)基也需避光放置及添加。

4. 棄掉96孔板內(nèi)各孔的上清，對照組加入PBS，實驗組避光加入100-200?μL含CCK-8的完全培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱中孵育。

注：為保證各孔內(nèi)CCK-8溶液和培養(yǎng)基比例一致，則先混合二者再統(tǒng)一添加。如果不考慮各孔之間的誤差，或者為了實驗操作的便利性（如對石蠟封閉的細(xì)胞進(jìn)行活力測定），則根據(jù)孔內(nèi)培養(yǎng)基體積推算需加CCK-8的量，直接吸取CCK-8溶液向孔內(nèi)添加。

5. 孵育2h后（時間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等情況而定），無須任何處理，避光條件下，盡快將96孔板上機(jī)處理。

6. 將96孔板置于酶標(biāo)儀內(nèi)測定OD值。波長設(shè)置為450nm，獲得數(shù)據(jù)結(jié)果后，導(dǎo)出Excel表用于后續(xù)分析。

7. 移去96孔板內(nèi)的混合溶液，并再清水沖洗后，丟棄處理。

不同應(yīng)用場景的操作方法

1. 細(xì)胞生長曲線：生長曲線測定天數(shù)為1-7天，按照天數(shù)準(zhǔn)備96孔板個數(shù)，每天消耗一塊板。每板上每組的復(fù)孔數(shù)，接種的細(xì)胞個數(shù)，使用的培養(yǎng)基及體積，加入的CCK-8溶液量及其作用時長均要保持一致。

2. 藥物、因子、培養(yǎng)體系對細(xì)胞生長的促進(jìn)/抑制作用：為了保證各板各組細(xì)胞的一致性，最好先統(tǒng)一接種細(xì)胞后，第二天再更換成特殊的培養(yǎng)體系。接種時額外備一份經(jīng)過同樣處理的對照板，用于第二天的OD值測定，以確定起始的數(shù)據(jù)量。更換特殊培養(yǎng)體系后，可根據(jù)實驗方案在特定的時間選取樣品板進(jìn)行CCK-8檢測，結(jié)合起始OD值數(shù)據(jù)一并分析。

傳統(tǒng)的細(xì)胞活力檢測方法：MTT法

MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在540或720nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。

MTT法與CCK-8法的操作差異

1. 由于CCK-8的水溶性，作用完成后不需要使用DMSO溶解，可直接上機(jī)測定；而MTT法則需移除上清，每孔加入150μL?DMSO溶解孔底水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚

2.?CCK-8一般作用時長更短，通常為2-3h，MTT為4h

3.?酶標(biāo)儀使用的波長不同，CCK-8在?450nm?波長處測定?OD?值，MTT因儀器參數(shù)所限，通常在實際操作中使用?490nm波長處測定 OD 值

4.?CCK-8對細(xì)胞毒性更小，相對來說也更加安全

作者：海星生物 公眾號：Cas9X細(xì)胞基因編輯

以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供

服務(wù)內(nèi)容：CRISPR/Cas9細(xì)胞基因編輯　載體/病毒包裝 PDO/動物模型CDX　穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 干細(xì)胞/原代細(xì)胞 培養(yǎng)試劑盒