? ? ? ? 今天我們介紹蝌蚪病毒(Head-Tail Virus)。蝌蚪病毒包括蝌蚪噬菌體(Caudovirus)與皰疹病毒(Herpesvirus)，首先，我們介紹的病毒是蝌蚪噬菌體的典型代表——大腸桿菌T4噬菌體(T4 Virus、Bacteriophage T4)。

簡介

? ? ? ? 大腸桿菌T4噬菌體是一種感染大腸桿菌的噬菌體。它是肌尾病毒(Myovirus)科T偶數(shù)噬菌體(Tevenvirus)亞科中的雙鏈DNA病毒。大腸桿菌T4噬菌體是典型的烈性病毒。該物種以前被命名為T偶數(shù)噬菌體，該名稱還包括大腸桿菌T2噬菌體、大腸桿菌T4噬菌體、大腸桿菌T6噬菌體以及其他菌株。

? ? ? ?噬菌體的意思是“細(xì)菌吞噬者”，眾所周知，噬菌體是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖，當(dāng)宿主被裂解破壞時被釋放。T4噬菌體的完整基因組序列包含168903個堿基對，編碼約300個基因產(chǎn)物。T4噬菌體在病毒學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

病毒歷史

? ? ? 噬菌體首先由英國科學(xué)家Frederick Twort于 1915 年和Félix d'Hérelle于1917年發(fā)現(xiàn)。 在1930年代后期，TL Rakieten向兩位研究人員Milislav提出了原始污水的混合物或被原始污水感染的大腸桿菌的裂解物。德梅雷克和烏戈·法諾，這兩位研究人員從大腸桿菌中分離出T3、T4、T5和T6。 此外，在1932年，研究人員J. Bronfenbrenner 研究并研究了T2噬菌體，從病毒中分離出T2噬菌體。而Max Delbrück參與了T偶數(shù)噬菌體的發(fā)現(xiàn)。?

? ? ? ?T4噬菌體分離的具體時間和地點(diǎn)尚不清楚，盡管它們很可能在污水或糞便中發(fā)現(xiàn)。1944年11月，Thomas F. Anderson、Max Delbrück 和 Milislav Demerec 在一篇論文中描述了T4噬菌體和T4樣噬菌體。1943 年，Salvador Luria和Delbrück表明噬菌體抗性的細(xì)菌突變是在沒有選擇的情況下出現(xiàn)的，而不是對選擇的反應(yīng)。1943 年之前，細(xì)菌學(xué)家的傳統(tǒng)觀點(diǎn)是細(xì)菌沒有基因。Luria-Delbrück實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌與其他已建立的模型遺傳生物一樣，具有基因，并且這些基因可以自發(fā)變異產(chǎn)生突變體，然后可以繁殖形成克隆譜系。 那一年，他們還開始與另一位噬菌體實(shí)驗(yàn)者阿爾弗雷德·赫爾希(Alfred Hershey)合作。因?yàn)樵诓《緩?fù)制機(jī)制和遺傳學(xué)方面的工作，三人將其享1969年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

? ? ? ??噬菌體小組是一個以Max Delbrück為中心的非正式生物學(xué)家網(wǎng)絡(luò)，主要對T4噬菌體進(jìn)行基礎(chǔ)研究，并在20世紀(jì)中葉對微生物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的起源做出了許多開創(chuàng)性的貢獻(xiàn)。1961年，噬菌體小組的早期成員悉尼·布倫納(Sydney Brenner)與弗朗西斯·克里克(Francis Crick)、萊斯利·巴內(nèi)特(Leslie Barnett)和理查德·沃茨-托賓(Richard Watts-Tobin)在劍橋卡文迪什實(shí)驗(yàn)室合作進(jìn)行了基因?qū)嶒?yàn)，證明了蛋白質(zhì)遺傳密碼的基本性質(zhì)。這些用T4噬菌體的rIIB基因突變體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，對于編碼蛋白質(zhì)的基因，該基因DNA的三個連續(xù)堿基指定了蛋白質(zhì)的每個連續(xù)氨基酸。因此遺傳密碼是一個三元組密碼，其中每個三元組(稱為密碼子)指定一個特定的氨基酸。他們還獲得了證據(jù)，證明編碼蛋白質(zhì)的 DNA 序列中的密碼子不相互重疊，并且此類序列是從固定起點(diǎn)讀取的。

? ? ? ?在1962~1964年間，T4噬菌體研究人員提供了一個機(jī)會，可以研究幾乎所有在實(shí)驗(yàn)室條件下對噬菌體生長至關(guān)重要的基因的功能。兩類條件致死突變體的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了這些研究。 一類這樣的突變體被稱為琥珀突變體。另一類條件致死突變體被稱為溫度敏感突變體對這兩類突變體的研究導(dǎo)致對許多基本生物學(xué)問題的深入了解。 因此，通過對T4噬菌體的研究，人們了解DNA復(fù)制、修復(fù)和重組機(jī)制中所用蛋白質(zhì)的功能和相互作用，以及病毒如何從蛋白質(zhì)和核酸成分(分子形態(tài)發(fā)生)組裝而成。闡明了鏈終止密碼子的作用。一項(xiàng)值得注意的研究使用了編碼T4噬菌體主要頭部蛋白的基因缺陷的琥珀突變體。該實(shí)驗(yàn)為廣泛持有但在1964年之前仍未得到證實(shí)的“序列假設(shè)”提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，即蛋白質(zhì)的氨基酸序列由決定蛋白質(zhì)的基因的核苷酸序列指定。

? ? ? ? 因此，這項(xiàng)研究證明了基因與其編碼的蛋白質(zhì)的共線性。

? ? ? ?許多諾貝爾獎獲得者研究過T4噬菌體或T4樣噬菌體，包括Max Delbrück、Salvador Luria、Alfred Hershey、James D. Watson和Francis Crick。其他研究過T4噬菌體的重要科學(xué)家包括邁克爾·羅斯曼、西摩·本澤、布魯斯·阿爾伯特、吉塞拉·莫西格、理查德·倫斯基和詹姆斯·布爾。

病毒學(xué)特征

? ? ? ?T4噬菌體是一種相對較大的病毒，大約 90 nm 寬和 200 nm 長(大多數(shù)病毒的長度范圍為 25 到 200 nm)。DNA基因組位于二十面體頭部，也稱為衣殼。T4噬菌體的尾巴是空心的，因此它可以將其核酸在附著后傳遞到它所感染的細(xì)胞中。像T4噬菌體這樣的噬菌體具有復(fù)雜的可收縮尾部結(jié)構(gòu)，大量蛋白質(zhì)參與尾部組裝和功能。尾纖維在識別宿主細(xì)胞表面受體方面也很重要，因此它們可以確定細(xì)菌是否在病毒的宿主范圍內(nèi)。?

? ? ? ?科學(xué)家通過電腦技術(shù)，對T4噬菌體13種不同蛋白質(zhì)(基因產(chǎn)物 5、5.4、6、7、8、9、10、11、12、25、27、48 和 53)的127條多肽鏈的6百萬道爾頓T4噬菌體基板的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，創(chuàng)建了由gp54和主管蛋白gp19形成的尾管近端區(qū)域的原子模型。雖然卷尺蛋白gp29存在于底板-尾管復(fù)合物中，但無法建模。

? ? ? ?在T4噬菌體病毒粒子的組裝過程中，由噬菌體基因編碼的形態(tài)發(fā)生蛋白以特征序列彼此相互作用。 在病毒感染期間產(chǎn)生的每種蛋白質(zhì)的數(shù)量保持適當(dāng)?shù)钠胶馑坪鯇φ５氖删w T4 形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要。決定病毒體結(jié)構(gòu)的噬菌體 T4 編碼的蛋白質(zhì)包括主要結(jié)構(gòu)成分、次要結(jié)構(gòu)成分和催化形態(tài)發(fā)生序列中特定步驟的非結(jié)構(gòu)蛋白。Yap和Rossman詳細(xì)介紹了T4噬菌體的形態(tài)發(fā)生分為三個獨(dú)立的途徑：頭部、尾部和長尾纖維。

病毒基因組

? ? ? ?T4噬菌體的雙鏈DNA基因組長約169kbp，編碼289種蛋白質(zhì)。T4噬菌體基因組是末端冗余的。在DNA復(fù)制時，可能通過滾環(huán)復(fù)制機(jī)制形成長的多基因組長度的串聯(lián)體。包裝后，串聯(lián)體在相同長度的非特定位置被切割，導(dǎo)致幾個代表原始循環(huán)排列的基因組。雖然是感染原核細(xì)胞的病毒，但是T4噬菌體基因組帶有類似真核生物的內(nèi)含子序列。

Shine-Dalgarno序列

? ? ? ?Shine-Dalgarno序列GAGG在病毒T4噬菌體早期基因中占主導(dǎo)地位，而序列GGAG是啟動早期mRNA降解的T4核酸內(nèi)切酶RegB的靶標(biāo)。

病毒入侵

? ? ? ? T4噬菌體通過將OmpC孔蛋白和脂多糖(LPS)與大腸桿菌細(xì)胞表面的長尾纖維(LTF)結(jié)合來引發(fā)大腸桿菌感染。識別信號通過LTF發(fā)送到基板。這會解開與大腸桿菌細(xì)胞表面不可逆結(jié)合的短尾纖維(STF)。底板改變構(gòu)象，尾鞘收縮，導(dǎo)致尾管末端的GP5刺破細(xì)胞外膜。GP5的溶菌酶結(jié)構(gòu)域被激活并降解周質(zhì)肽聚糖層。膜的剩余部分被降解，然后來自病毒頭部的DNA可以穿過尾管進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞。

? ? ? ?1952年，Hershey和Chase提供了關(guān)鍵證據(jù)，表明噬菌體DNA與蛋白質(zhì)不同，在感染時進(jìn)入宿主細(xì)菌細(xì)胞，因此是噬菌體的遺傳物質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)表明，DNA是大多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)。

復(fù)制

? ? ? ? 裂解生命周期(從進(jìn)入細(xì)菌到破壞細(xì)菌)大約需要30分鐘(37 °C)。毒性噬菌體進(jìn)入后立即在其細(xì)菌宿主中繁殖。子代噬菌體數(shù)量達(dá)到一定數(shù)量后，使宿主發(fā)生裂解，從而被釋放出來感染新的宿主細(xì)胞。 宿主裂解和釋放的過程稱為裂解循環(huán)。裂解循環(huán)是病毒繁殖的循環(huán)，涉及破壞受感染細(xì)胞及其膜。 這個循環(huán)涉及一種病毒，它會超越宿主細(xì)胞及其繁殖機(jī)制。 因此，病毒必須經(jīng)過5個階段才能繁殖和感染宿主細(xì)胞：

1.吸附滲透(立即開始)

2.阻止宿主基因表達(dá)(立即開始)

3.酶合成(5分鐘后開始)

4.DNA復(fù)制(10分鐘后開始)

5.新病毒顆粒的形成(12分鐘后開始)

? ? ? ?生命周期結(jié)束后，宿主細(xì)胞裂解，將新構(gòu)建的病毒噴射到環(huán)境中，破壞宿主細(xì)胞。T4噬菌體的爆發(fā)大小約為每個受感染宿主100~150個病毒顆粒。

? ? ? ? Benzer(1955~1959)開發(fā)了一個系統(tǒng)，用于使用 rIIA 和 rIIB 基因缺陷的T4噬菌體突變體研究基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)。所采用的技術(shù)是互補(bǔ)測試和雜交以檢測重組，特別是在缺失突變之間。 這些遺傳實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)突變位點(diǎn)的獨(dú)特線性順序。 這一結(jié)果為關(guān)鍵思想提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，即該基因具有相當(dāng)于一段DNA的線性結(jié)構(gòu)，具有許多可以獨(dú)立變異的位點(diǎn)。

吸附滲透

? ? ? ?就像所有其他病毒一樣，T偶數(shù)噬菌體不只是隨機(jī)附著在宿主表面；相反，它們“搜索”并結(jié)合受體，即宿主表面發(fā)現(xiàn)的特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 這些受體因噬菌體而異；磷壁酸、細(xì)胞壁蛋白和脂多糖、鞭毛和菌毛都可以作為噬菌體結(jié)合的受體。為了讓T偶數(shù)噬菌體感染宿主并開始其生命周期，它必須進(jìn)入第一個感染過程，即噬菌體吸附到細(xì)菌細(xì)胞上。吸附是噬菌體-宿主對的一個重要特征，噬菌體在宿主細(xì)胞表面的吸附被描述為一個2個階段的過程：可逆和不可逆。它涉及噬菌體尾部結(jié)構(gòu)，當(dāng)噬菌體尾部纖維幫助噬菌體與其宿主的適當(dāng)受體結(jié)合時，該結(jié)構(gòu)開始。這個過程是可逆的。底板的一種或多種成分介導(dǎo)噬菌體與細(xì)菌結(jié)合的不可逆過程。

? ? ? 滲透也是噬菌體-宿主感染的一個重要特征，它涉及將噬菌體遺傳物質(zhì)注入細(xì)菌內(nèi)部。 核酸的滲透發(fā)生在不可逆吸附階段之后。 涉及噬菌體核酸滲透的機(jī)制對于每個噬菌體是特異性的。 這種滲透機(jī)制可能涉及電化學(xué)膜電位、ATP 分子、肽聚糖層的酶促分裂，或者所有這三個因素對于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸滲透至關(guān)重要。 已經(jīng)對T2噬菌體(T4樣噬菌體)的滲透機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明噬菌體的尾部不會滲透到細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)部，這種噬菌體的滲透涉及內(nèi)膜上的電化學(xué)膜電位。

復(fù)制與基因組包裝

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? ? ??T4噬菌體基因組是在宿主細(xì)胞內(nèi)使用滾環(huán)復(fù)制合成的。DNA在活細(xì)胞中復(fù)制所需的時間被測量為病毒感染的大腸桿菌中T4 DNA 延伸的速率。 在37°C下DNA呈指數(shù)增長期間，速率為每秒749個核苷酸。在T4 DNA合成過程中，每次復(fù)制每個堿基對的突變率為1.7x10^-8，一種高度準(zhǔn)確的DNA復(fù)制機(jī)制，300個拷貝中只有1個錯誤。此外，該病毒還編碼獨(dú)特的DNA修復(fù)機(jī)制。T4噬菌體頭部圍繞支架蛋白組裝成空的，隨后降解。因此DNA需要通過一個小孔進(jìn)入前頭，這是通過gp17的六聚體首先與DNA 相互作用來實(shí)現(xiàn)的，DNA也充當(dāng)馬達(dá)和核酸酶。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T4 DNA包裝電機(jī)以高達(dá)每秒2000個堿基對的速度將DNA加載到病毒衣殼中。 所涉及的功率，如果按比例放大，將相當(dāng)于普通汽車發(fā)動機(jī)的功率。

病毒釋放

? ? ? ? 病毒繁殖和繁殖的最后一步是由宿主細(xì)胞釋放病毒粒子決定的。 病毒粒子的釋放發(fā)生在細(xì)菌細(xì)胞膜破裂后。病毒裂解宿主細(xì)胞，其特征是病毒蛋白攻擊肽聚糖或膜。 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的衣殼釋放分解細(xì)胞壁的溶菌酶時，細(xì)菌就會發(fā)生裂解。 釋放的噬菌體感染其他細(xì)胞，病毒增殖周期在這些細(xì)胞內(nèi)重復(fù)進(jìn)行。

多重激活(MR)

? ? ? 多重激活(MR)是兩個或多個病毒基因組(每個都包含失活的基因組損傷)可以在受感染細(xì)胞內(nèi)相互作用以形成可行病毒基因組的過程。Salvador Luria在1946年研究紫外線照射T4噬菌體時，發(fā)現(xiàn)了MR，并提出觀察到的受損病毒的再激活是通過重組機(jī)制發(fā)生的。這在DNA確認(rèn)之前 1952 年通過Hershey-Chase實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相關(guān)病毒T2噬菌體中的遺傳物質(zhì)。

? ? ? ? 正如Luria所記得的，輻射病毒再激活(稱為“多重激活”)的發(fā)現(xiàn)立即開始了早期噬菌體組內(nèi)輻射損傷修復(fù)研究的一系列活動。后來發(fā)現(xiàn)，盧里亞發(fā)現(xiàn)的互助修復(fù)受損病毒只是DNA修復(fù)的一個特例。現(xiàn)在已知所有類型的細(xì)胞，不僅是細(xì)菌及其病毒，而且包括人類在內(nèi)的所有研究過的生物體都具有修復(fù)DNA損傷的復(fù)雜生化過程。DNA修復(fù)過程現(xiàn)在也被認(rèn)為在防止衰老、癌癥和不孕癥方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

? ? ? ?MR通常由“存活曲線”表示，其中將多重感染細(xì)胞(多復(fù)合體)的斑塊形成能力的存活率與基因組損傷劑的劑量作圖。 為了進(jìn)行比較，還針對基因組損傷劑的劑量繪制了單獨(dú)感染細(xì)胞(單一復(fù)合物)的病毒噬菌斑形成能力的存活率。 上圖顯示了隨著紫外線劑量增加，T4噬菌體復(fù)合物和單一復(fù)合物的存活曲線。由于存活率是以對數(shù)標(biāo)度繪制的，很明顯，多復(fù)合體的存活率超過了單復(fù)合體的存活率非常大的因素(取決于劑量)。多復(fù)合體的UV滅活曲線有一個初始肩峰。 其他T4 DNA損傷劑在其多復(fù)合體生存曲線中在X射線和甲磺酸乙酯(EMS)影響下存在一個“肩部”。肩部的存在被解釋為意味著使用了兩個重組過程。 第一個以高效率(在“肩膀”中)修復(fù)DNA，但隨著損傷的增加其能力飽和；第二種途徑在所有損傷水平上起作用。多復(fù)合體中存活的T4噬菌體未顯示突變增加，表明紫外線照射下病毒的MR是一個準(zhǔn)確的過程。?

? ? ? ???下圖顯示了DNA損傷劑絲裂霉素C(MMC) 滅活T4噬菌體的存活曲線。在這種情況下，多重復(fù)合物的生存曲線沒有初始肩峰，表明只有上述第二次重組修復(fù)過程處于活動狀態(tài)。 這一過程的修復(fù)效率由觀察結(jié)果表明，即 1000 個單一復(fù)合體中僅允許1個存活的MMC劑量允許約 70%的復(fù)合體存活。對于DNA損傷劑P32衰變、補(bǔ)骨脂素加近紫外線照射(PUVA)、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、甲磺酸甲酯(MMS)也獲得了類似的多復(fù)合體生存曲線和亞硝酸。

? ? ? ?T4噬菌體中MR所必需的幾個基因被證明是原核生物、真核生物和古細(xì)菌中重組所必需基因的直向同源物。 這包括，例如，T4噬菌體基因uvsX，它指定了一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與來自大腸桿菌的RecA和真核生物中的同源蛋白質(zhì)RAD51和古細(xì)菌中的RadA具有三維結(jié)構(gòu)同源性。有人提出，MR期間DNA損傷的有效和準(zhǔn)確的重組修復(fù)可能類似于真核生物減數(shù)分裂期間發(fā)生的重組修復(fù)過程。

T4DNA連接酶

? ? ? ?T4 DNA連接酶來自T4噬菌體(一種感染大腸桿菌的噬菌體)，T4 DNA連接酶是實(shí)驗(yàn)室研究中最常用的。它可以連接DNA、寡核苷酸以及 RNA和RNA-DNA雜交體的粘性末端或平末端，但不能連接單鏈核酸。它還可以以比大腸桿菌DNA連接酶高得多的效率連接平端DNA。 與大腸桿菌DNA連接酶不同，T4 DNA連接酶不能利用NAD，它需要ATP作為輔助因子。

? ? ? ?科學(xué)家已經(jīng)進(jìn)行了一些工程來提高T4 DNA連接酶的體外活性； 例如，一種成功的方法測試了與幾種替代DNA結(jié)合蛋白融合的T4 DNA連接酶，發(fā)現(xiàn)以p50或NF-kB作為融合伙伴的構(gòu)建體在用于克隆目的的平端連接中的活性比野生型高160%以上。將片段插入質(zhì)粒載體的典型反應(yīng)將使用約0.01(粘性末端)至1(平末端)個單位的連接酶。T4 DNA連接酶的最佳反應(yīng)溫度為16°C。

? ? ? ? T4 DNA連接酶突變體對紫外線照射和烷化劑甲磺酸甲酯的敏感性增加，表明DNA連接酶用于修復(fù)由這些因子引起的DNA損傷。