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此前，我們分享了染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序(ChIP-seq）的數(shù)據(jù)挖掘思路（點(diǎn)擊查看詳情），進(jìn)而篩選出TF結(jié)合/組蛋白修飾的目標(biāo)區(qū)域和候選靶基因。

做完ChIP-seq測(cè)序后，如果需要對(duì)分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗(yàn)證，則需要進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。ChIP-seq的進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)包括以下5個(gè)方面：

1. 簡(jiǎn)單驗(yàn)證

2. 轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證是否影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能

3. 靶向目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其影響下游靶基因的表達(dá)

4. 引入突變后，熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達(dá)

5. 超級(jí)增強(qiáng)子

一、簡(jiǎn)單驗(yàn)證

（1）目標(biāo)基區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合/組蛋白修飾的驗(yàn)證：CHIP-qPCR

（2）檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR

（3）檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot

二、轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證是否影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能

（1）轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾：基因的突變/敲降/敲除/過(guò)表達(dá)、相關(guān)蛋白的抑制劑

（2）檢測(cè)TF結(jié)合/組蛋白修飾的整體變化：CHIP-seq

（3）檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾的變化：CHIP-qPCR

（4）檢測(cè)下游靶基因的mRNA水平：RT-qPCR

（5）檢測(cè)下游靶基因蛋白質(zhì)水平：Western blot

（6）檢測(cè)細(xì)胞功能/表型變化

三、靶向目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其影響下游靶基因的表達(dá)

（1）目的基因結(jié)合/修飾干擾細(xì)胞系的構(gòu)建：熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)（Luciferase activity assay）、CRISPER-CAS9靶向目標(biāo)區(qū)域引入突變/修飾

• 確定并驗(yàn)證與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif

• 驗(yàn)證與該motif結(jié)合之后是否能影響靶基因表達(dá)

• 不同區(qū)域引入突變以確定關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)

（2）檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾變化：CHIP-qPCR

（3）檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR

（4）檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot

（5）檢測(cè)細(xì)胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標(biāo)志物測(cè)定……

用于驗(yàn)證TF結(jié)合并調(diào)控下游基因的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

四、引入突變后，熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達(dá)

top3的motif中，只有MEME-2能夠激活熒光素酶基因表達(dá)，表明FUS1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的是MEME-2 motif

在靶基因3’UTR插入熒光素酶基因，只有FUS1組能夠激活熒光素酶基因的表達(dá)，表明只有FUS1組具有轉(zhuǎn)錄因子活性

引入S486E突變影響到該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)MEME-2的結(jié)合，也最終影響到靶基因的表達(dá)

五、超級(jí)增強(qiáng)子

（1）根據(jù)通用型轉(zhuǎn)錄輔因子Med1在CHIP-seq實(shí)驗(yàn)中富集程度的高低，可以將增強(qiáng)子分為以下兩類:

typical enhancers（TE）：長(zhǎng)度為幾百bp

super enhancers（SE）：長(zhǎng)度幾千bp

（2）超級(jí)增強(qiáng)子的預(yù)測(cè)建立在增強(qiáng)子的基礎(chǔ)上，可以看做增強(qiáng)子富集的區(qū)域。

（3）相比增強(qiáng)子，超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域具有更高的轉(zhuǎn)錄因子的密度，能夠讓轉(zhuǎn)錄效率提高達(dá)幾百倍。

（4）H3K27ac是活性增強(qiáng)子的標(biāo)志，可以通過(guò)H3K27ac CHIP-seq鑒定TE和SE。

CHIP-seq實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵問(wèn)題

（1）抗體質(zhì)量

ChIP-seq是基于抗體的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，因此它的數(shù)據(jù)質(zhì)量好壞直接取決于抗體的質(zhì)量和特異性。

另外，針對(duì)同一蛋白的不同抗體，可能會(huì)識(shí)別不同的表位（尤其是單克隆抗體）。因此建議針對(duì)同一感興趣蛋白測(cè)試不同的抗體，通過(guò)Western blot檢測(cè)knock-down前后的差異幫助選擇。

（2）測(cè)序數(shù)據(jù)量

為了捕獲所有真實(shí)的結(jié)合位點(diǎn)，而我們看不見(jiàn)摸不著，只能通過(guò)測(cè)序的reads去計(jì)算來(lái)幫助判斷，因此測(cè)序reads的數(shù)量是一個(gè)決定因素。

需要多少reads呢？

這個(gè)取決于基因組的大小和感興趣因子的結(jié)合方式（sharp regions for TFs and broad regions for histone marks）。哺乳動(dòng)物中，鑒定TFs至少要滿足10-20M，broad histone marks至少要10-45M，input對(duì)照要和ChIP樣本保持同樣測(cè)序深度。reads數(shù)量還取決于抗體質(zhì)量和免疫沉淀的效率。信噪比越高，需要的reads數(shù)可以適當(dāng)減少。

（3）生物學(xué)重復(fù)

樣本重復(fù)可以看到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的好壞，選擇相關(guān)性高的樣本進(jìn)行后續(xù)分析

推薦三個(gè)生物重復(fù)，但兩個(gè)現(xiàn)在也能接受（最粗略的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)就是：每個(gè)ChIP樣本2個(gè)重復(fù)，input只有一個(gè)沒(méi)有重復(fù)）

如果樣本間的本質(zhì)差異越大，越需要設(shè)置重復(fù)，例如從不同人取的樣本。

關(guān)于易基因染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序?(ChIP-seq)

染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典方法。將ChIP與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，可在全基因組范圍對(duì)特定蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行高效而準(zhǔn)確的篩選與鑒定，為研究的深入開(kāi)展打下基礎(chǔ)。

DNA與蛋白質(zhì)的相互作用與基因的轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)的空間構(gòu)型和構(gòu)象密切相關(guān)。運(yùn)用組蛋白特定修飾的特異性抗體或DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子特異性抗體富集與其結(jié)合的DNA片段，并進(jìn)行純化和文庫(kù)構(gòu)建，然后進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組精確比對(duì)，研究人員可獲得全基因組范圍內(nèi)某種修飾類型的特定組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子與基因組DNA序列之間的關(guān)系，也可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行差異比較。

應(yīng)用方向：

ChIP 用來(lái)在空間上和時(shí)間上不同蛋白沿基因或基因組定位

• 轉(zhuǎn)錄因子和輔因子結(jié)合作用

• 復(fù)制因子和 DNA 修復(fù)蛋白

• 組蛋白修飾和變異組蛋白

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 物種范圍廣：細(xì)胞、動(dòng)物組織、植物組織、細(xì)菌微生物多物種富集經(jīng)驗(yàn)；

• 微量建庫(kù)：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展開(kāi)測(cè)序分析；

• 方案靈活：根據(jù)不同的項(xiàng)目需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體。

技術(shù)路線：