細(xì)胞計(jì)數(shù)：我們中的許多人每天很多次的檢測(cè)，大多數(shù)是基于細(xì)胞為基礎(chǔ)，但細(xì)胞計(jì)數(shù)，或者更準(zhǔn)確地說(shuō)，“準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)”可能非常困難。BIOFOUNT公司 帶您探討不同的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法、它們的用途以及各種細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的局限性，幫助大家選擇出適合您實(shí)驗(yàn)室需求的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。

?文章源于：BIOFOUNT細(xì)胞計(jì)數(shù)板部門

細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測(cè)定對(duì)于幾乎所有的臨床和轉(zhuǎn)化研究應(yīng)用都至關(guān)重要，然而，在細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中存在許多陷阱，這可能會(huì)對(duì)測(cè)定性能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。為了解決這些問(wèn)題，過(guò)去十年中，細(xì)胞計(jì)數(shù)領(lǐng)域取得了很大的進(jìn)展，使細(xì)胞計(jì)數(shù)這一傳統(tǒng)過(guò)程變的高度自動(dòng)化和智能化。

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一、細(xì)胞計(jì)數(shù)（血球法）

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細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)雖然在進(jìn)步，血球細(xì)胞計(jì)數(shù)法仍然是許多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞研究的黃金標(biāo)準(zhǔn)。血球計(jì)數(shù)法是由Louis-Charles Malassez發(fā)明的，用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)，這種方法可以用于不同樣本類型中的細(xì)胞計(jì)數(shù)，包括血液、細(xì)胞培養(yǎng)物、尿液和水樣等。在將樣品加載到血球計(jì)數(shù)板上之前，可以使用活性染料如：臺(tái)盼藍(lán)來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

?國(guó)產(chǎn)一次性血球計(jì)數(shù)板制造商:BIOFOUNT

其核心，血球計(jì)數(shù)板是一種上部需要配載玻片的100um腔體，其主要特征是：網(wǎng)格，在一個(gè)9平方毫米的區(qū)間，勾勒出一個(gè)1毫米x 1毫米的區(qū)域，將每個(gè)正方形相交成橫截面，形成0.00025平方毫米的最小細(xì)分單元。當(dāng)用蓋玻片覆蓋時(shí)，可以形成了一個(gè)0.1毫米高的腔室，因此在這個(gè)空腔內(nèi)就可以產(chǎn)生了一個(gè)已知體積的空間。

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通常我們使用4倍或10倍物鏡對(duì)四個(gè)角1mm x 1mm正方形中的每一個(gè)區(qū)內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算出平均值。細(xì)胞數(shù)量等于=平均細(xì)胞數(shù)x 10的四次方?x稀釋因子

為了細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)的穩(wěn)定性，每平方毫米建議100-200個(gè)細(xì)胞。有時(shí)候細(xì)胞密度不夠高，無(wú)法達(dá)到這一密度，其他情況下，我們可能需要對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行稀釋，這是稀釋因子可能至關(guān)重要。

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使用血球計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，會(huì)受到許多因素的影響，主要是我們?cè)诨旌稀⒁埔汉吞幚磉^(guò)程中的各種可變性，以及實(shí)驗(yàn)室之間儀器以及材料的差異造成的。其中：稀釋因子之間的不確定性帶來(lái)誤差可能>55%，根據(jù)以往細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)員之間的變化帶來(lái)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果差別高達(dá)52%（Freund和Carol，1964）。為了克服細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中這些高變異系數(shù)，一般建議同一樣本需要多次計(jì)數(shù)。實(shí)際試驗(yàn)中，尤其在高通量的實(shí)驗(yàn)室中，該方法難以執(zhí)行？

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為了解決血球計(jì)細(xì)胞計(jì)數(shù)法中的一些局限性，BIOFOUNT公司（細(xì)胞計(jì)數(shù)類產(chǎn)品公司）?提出了一些簡(jiǎn)單實(shí)用的方法，可以幫助血球細(xì)胞計(jì)數(shù)法的統(tǒng)計(jì)精度：

1.?在采集樣本和等分多個(gè)樣本之前，需對(duì)樣本進(jìn)行徹底混合和搖勻，可以提高統(tǒng)計(jì)顯著性和細(xì)胞計(jì)數(shù)的穩(wěn)定性；

2.?在細(xì)胞計(jì)數(shù)之前，在使用細(xì)胞樣品前，采取過(guò)濾來(lái)減少樣品內(nèi)的團(tuán)塊；

3.?當(dāng)使用活性染料時(shí)，重點(diǎn)是：在細(xì)胞計(jì)數(shù)之前不要等待太久；臺(tái)盼藍(lán)是一種常見(jiàn)的死細(xì)胞染料，如果細(xì)胞接觸這種有毒染料超過(guò)10分鐘，可能會(huì)使死細(xì)胞或活細(xì)胞都被染色。因此，請(qǐng)確保染色和計(jì)數(shù)的效率。或者使用不可滲透細(xì)胞膜的DNA染料，如（DAPI），它只會(huì)被死細(xì)胞吸收；

4.?移液器的校準(zhǔn)——對(duì)于細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，移液器的維護(hù)和校準(zhǔn)也至關(guān)重要；

5.?對(duì)連續(xù)稀釋樣品進(jìn)行分析，如：擦拭移液吸頭尖端外表面的多余液滴；

6.?正確的放置蓋玻片并將樣品加載到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，以確保細(xì)胞計(jì)數(shù)板腔體內(nèi)沒(méi)有氣泡。另一個(gè)需要考慮的因素是：較大的細(xì)胞可能集中在腔體的邊緣，這可能會(huì)影響需要統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)量。

7.?用酒精清洗對(duì)蓋玻片和血球板進(jìn)行清洗，以確保碎屑清除，也需確保整個(gè)腔體內(nèi)細(xì)胞均勻分布。由于細(xì)胞懸浮液樣品通過(guò)虹吸作用進(jìn)入腔體，任何碎屑或氣穴都可能破壞細(xì)胞進(jìn)入腔體這一過(guò)程。

8.?標(biāo)準(zhǔn)化操作流程--由于血球計(jì)數(shù)法是一個(gè)手動(dòng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程，沒(méi)有規(guī)范化的計(jì)數(shù)方法可能會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的重復(fù)精確性；標(biāo)準(zhǔn)化則尤為重要。

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二、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀選擇時(shí)的注意事項(xiàng)

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由于人工細(xì)胞計(jì)數(shù)涉及如此多的因素和存在主觀性，因此，許多自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在商業(yè)上獲得成功并不足為奇，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀克服了觀察者間的差異性和血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞分布相關(guān)的諸多問(wèn)題。隨著細(xì)胞計(jì)數(shù)儀技術(shù)的不斷發(fā)展，為手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)提供了一種高效的替代方案。然而，每個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀都有優(yōu)缺點(diǎn)，因此了解和考慮特定實(shí)驗(yàn)室需求并選擇出需要的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀尤為重要。

自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀通常分為四種類型：阻抗（庫(kù)爾特原理）、光學(xué)（光散射）；流式細(xì)胞術(shù)和使用特殊染色的直接成像計(jì)數(shù)儀。每個(gè)平臺(tái)都有獨(dú)特的應(yīng)用場(chǎng)景和優(yōu)勢(shì)，因此研了解每種細(xì)胞計(jì)數(shù)原理和功能，并確保所采用的儀器符合實(shí)驗(yàn)室的需求是很重要的。

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三、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的工作原理？

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1.?阻抗法細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的工作原理是：當(dāng)細(xì)胞通過(guò)孔徑時(shí)，通過(guò)電阻抗的變化對(duì)單元進(jìn)行計(jì)數(shù)和調(diào)整大小。阻抗法是最早的自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的典型技術(shù)之一，在許多醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室中仍然很常見(jiàn)。

2.?光學(xué)法細(xì)胞計(jì)數(shù)儀使用由光電探測(cè)器探測(cè)細(xì)胞和對(duì)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。該方法在性質(zhì)上與流式細(xì)胞儀非常相似，例如：基于簡(jiǎn)單的散點(diǎn)圖來(lái)區(qū)分各種細(xì)胞類型。

3.?流式細(xì)胞術(shù)儀利用前向散射來(lái)識(shí)別細(xì)胞及其大小和體積，并結(jié)合側(cè)散射來(lái)提供關(guān)于細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜性的信息。側(cè)熒光也可用于測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的RNA和DNA含量。例如：也有制造出手持流式細(xì)胞儀，以支持非洲的艾滋病毒檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。許多現(xiàn)有技術(shù)的無(wú)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)平臺(tái)都利用專有算法使用透射光特征來(lái)描述從CHO和HeLa到THP-1和胚胎干細(xì)胞的許多常用細(xì)胞類型?；趲?kù)爾特和流式細(xì)胞儀的細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備可以廣泛的用于各種樣品和細(xì)胞類型。它們?cè)诓唤Y(jié)塊的細(xì)胞樣本上表現(xiàn)最好，這可能會(huì)導(dǎo)致巧合，從而誤讀細(xì)胞數(shù)量。Coulter和流式細(xì)胞儀細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是：它們兼容的細(xì)胞類型更為廣泛。包括：細(xì)胞培養(yǎng)和原代細(xì)胞、PBMC、酵母和細(xì)菌，但需要儀器或門控調(diào)整來(lái)識(shí)別感興趣的樣本群體。

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4.?細(xì)胞成像計(jì)數(shù)：近幾年成像細(xì)胞計(jì)數(shù)儀得到了快速發(fā)展。成像計(jì)數(shù)儀依賴于自動(dòng)聚焦和曝光技術(shù)，再加上機(jī)器的算法，對(duì)廣泛的細(xì)胞類型樣本、細(xì)胞大小和細(xì)胞密度范圍可以提供精確的統(tǒng)計(jì)。當(dāng)涉及到高度異源或具有更高聚集傾向的細(xì)胞樣本時(shí)，成像類的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可能具有更高的價(jià)值，因?yàn)樵撓到y(tǒng)能夠容易地破譯細(xì)胞團(tuán)塊之間的邊界并識(shí)別碎片、死亡/垂死細(xì)胞以及各種大小的細(xì)胞。

成像技術(shù)中的許多儀器采用了基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其提供了優(yōu)于臺(tái)盼藍(lán)的區(qū)分碎片的能力的解決方案。吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）的最佳組合之一被許多細(xì)胞計(jì)數(shù)平臺(tái)所使用。AO是膜可滲透的，可以染色活細(xì)胞的細(xì)胞核DNA，而PI只染色死細(xì)胞。來(lái)自這些染料中的每一種的熒光信號(hào)都很容易分辨，有核顆粒的陽(yáng)性染色有助于支持準(zhǔn)確的細(xì)胞活力測(cè)定。這對(duì)于PBMC計(jì)數(shù)特別有用，因?yàn)镽BCs基于其缺乏PI染色而易于區(qū)分。

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四、選擇細(xì)胞計(jì)數(shù)儀需要考慮的關(guān)鍵指標(biāo)

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1.?細(xì)胞計(jì)數(shù)的效率，不同細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的技術(shù)效率千差萬(wàn)別，根據(jù)自己樣本量選擇匹配技術(shù)效率的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；

2.?分析的樣本類型--根據(jù)樣本單元大小和復(fù)雜性的異質(zhì)性選擇所需的儀器。

3.?最佳精度與樣品量——同一儀器中同時(shí)實(shí)現(xiàn)效率和精度兩個(gè)目標(biāo)好像難以實(shí)現(xiàn)。根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)要求，精確的細(xì)胞計(jì)數(shù)是否至關(guān)重要，或者+/-20%偏差就足夠了？

4.?監(jiān)管合規(guī)性——因此審計(jì)試驗(yàn)是我們的一個(gè)重要考慮因素-您的實(shí)驗(yàn)室是否需要相關(guān)認(rèn)證？

5.?染色注意事項(xiàng)：是否需要有核細(xì)胞染色與無(wú)核細(xì)胞染色？

6.?便捷性--實(shí)驗(yàn)室需要臺(tái)式機(jī)還是手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀？

7.?所細(xì)胞計(jì)數(shù)動(dòng)態(tài)范圍--目前主流的計(jì)數(shù)儀基本都可以準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞密度低至1×104個(gè)細(xì)胞/每毫升到1 x 107個(gè)細(xì)胞/每毫升的樣本。

8.?界面用戶友好--便于識(shí)別、導(dǎo)出數(shù)據(jù)報(bào)告和進(jìn)行數(shù)據(jù)管理。

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五、細(xì)胞計(jì)數(shù)的總結(jié)

盡管許多自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀有類似的功能，但并不相同，并且許多不符合GLP/GMP或21 CRF第11部分的合規(guī)要求。目前有兩套與細(xì)胞計(jì)數(shù)儀有關(guān)的ISO指南：第1部分定義了細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程、方法選擇、樣品制備、測(cè)量、鑒定、驗(yàn)證、數(shù)據(jù)分析和報(bào)告的術(shù)語(yǔ)并提供了一般指南（ISO 20391-1:2018（en）生物技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)-第1部分）。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法通用指南）和提供細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量過(guò)程質(zhì)量指標(biāo)評(píng)估指南的第2部分（ISO 20391-2-2019生物技術(shù)-細(xì)胞計(jì)數(shù)-第2部分：量化計(jì)數(shù)方法性能的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析）。

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無(wú)論何時(shí)需要評(píng)估細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，都必須從樣本采集、稀釋和染色到數(shù)據(jù)采集、報(bào)告和數(shù)據(jù)管理的整個(gè)工作流程進(jìn)行審查。與任何實(shí)驗(yàn)室流程一樣，培訓(xùn)和標(biāo)準(zhǔn)程序是評(píng)估的重要組成部分。這么多不同的平臺(tái)和儀器可供選擇和使用，使的細(xì)胞計(jì)數(shù)從未如此容易和可靠，愿BIOFOUNT 給您帶來(lái)更好的細(xì)胞計(jì)數(shù)體驗(yàn)。

文章源于：BIOFOUNT細(xì)胞計(jì)數(shù)板部門