親和體分子是一種具有高親和能力的非免疫性蛋白，可以特異性地靶向腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)的細(xì)胞因子。然而，由于親和體在體內(nèi)半衰期相對(duì)較短，嚴(yán)重限制了其在靶向藥物中的應(yīng)用。在本文中，兩親性親和體-藥物偶聯(lián)物通過自組裝形成納米膠束以延長藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，采用靶向治療策略治療HER2陽性卵巢癌和乳腺癌。

Self?Assembled Nanomicelles of Affibody?Drug Conjugate with Excellent Therapeutic Property to Cure Ovary and Breast Cancers

Xuelin Xia, Xiaoyuan Yang, Wei Huang, Xiaoxia Xia*, Deyue Yan*

Nano-Micro Letters (2022)14: 33

本文亮點(diǎn)

1.?親和體ZHER2:342和MMAE的偶聯(lián)物在水溶液中通過分子自組裝技術(shù)成功制備具有靶向作用的納米膠束Z-MADCN。

2.?該納米膠束Z-M ADCN在HER2陽性的卵巢癌和乳腺癌模型中顯示出優(yōu)異的抗腫瘤性能，可以消除體積約為100 mm3和500 mm3的實(shí)體瘤，其腫瘤抑制率達(dá)99.8%，并且該納米藥物在體內(nèi)具有很好的生物安全性。

內(nèi)容簡介

乳腺癌和卵巢癌一直是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致女性死亡率最高的兩類癌癥。研究證實(shí)人皮生長因子受體2 (HER2)是一類酪氨酸激酶受體家族成員中的一員，在許多癌癥如乳腺癌和卵巢癌中存在過表達(dá)現(xiàn)象。在過去的幾十年中，針對(duì)HER2受體的單抗和抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)技術(shù)已經(jīng)被成功開發(fā)。該技術(shù)通過抗體作為載體將細(xì)胞毒素通過靶向遞送作用選擇性遞送到腫瘤部位，有效提高了細(xì)胞毒素的抗腫瘤作用。但ADC藥物依然存在不足之處，如抗體尺寸大，制備過程復(fù)雜，藥物偶聯(lián)位點(diǎn)的不確定性及對(duì)實(shí)體瘤的組織穿透性差等問題。

為解決以上問題，上海交通大學(xué)顏德岳教授課題組和夏小霞教授課題組，提出采用親和體蛋白與疏水藥物毒素偶聯(lián)制備親和體-藥物偶聯(lián)物并采用自組裝策略制備主動(dòng)靶向納米藥物以改善ADC藥物的不足。因親和體-藥物偶聯(lián)物ZHER2:342-MMAE的兩親性質(zhì)使其在水溶液中成功組裝形成120 nm左右的納米膠束，組裝后的納米膠束依然保持親和體蛋白的高親和性能。在HER2陽性卵巢癌(SKOV-3)和乳腺癌(BT474)腫瘤模型小鼠中，Z-MADCN納米藥物在兩種腫瘤模型中均獲得優(yōu)異的抗腫瘤性能，腫瘤抑制率高達(dá)99.8%，小鼠的腫瘤全部被治愈無復(fù)發(fā)，并且納米藥物在小鼠體內(nèi)具有很高的生物安全性。

圖文導(dǎo)讀

I?Z-M ADCN的制備及表征

親和體蛋白N端的巰基與海圖毒素的Linker馬來酰亞胺基團(tuán)通過邁克爾加成方法制備親和體-藥物偶聯(lián)物ZHER2:342-MMAE，該偶聯(lián)物的分子量為8438.14。在水溶液中該偶聯(lián)物自組裝形成膠束大小為120 nm左右的膠束結(jié)構(gòu)。自組裝形成納米膠束Z-M ADCN依然保持了ZHER2:342親和體的高親和性，其親和性大小約為6.44×10?? M。

圖1. (a, b) ZHER2:342親和體蛋白及ZHER2:342-MMAE偶聯(lián)物的MALDI-TOF質(zhì)譜圖；(c, d) ZHER2:342-MMAE自組裝形成納米膠束Z-M ADCN的DLS圖和TEM圖；(e, f) ZHER2:342親和體蛋白及Z-M ADCN分別與HER2受體胞外區(qū)域ECD之間的親和性檢測(cè)。

II?Z-M ADCN體外性能評(píng)價(jià)

采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)SKOV-3細(xì)胞攝取Z-M ADCN情況進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果顯示：隨著孵育時(shí)間的延長，Z-M ADCN很容易被SKOV-3細(xì)胞攝取進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，并且通過阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)Z-M ADCN通過HER2受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)。Z-M ADCN在HER2陽性細(xì)胞SKOV-3及BT474細(xì)胞中具有很好的生物活性，其IC??值分別為3.64 nM和8.08 nM。相較于HER2陰性細(xì)胞MDA-MB-231 (>100 nM), Z-M ADCN在HER2陽性細(xì)胞中具有更低的IC50，Z-M ADCN可以靶向HER2受體實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞層面上的靶向遞送。

圖2. Z-M ADCN體外性能研究。(a) SKOV-3細(xì)胞與Cy5.5標(biāo)記的Z-M ADCN共孵育不同時(shí)間(0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h)后的激光共聚焦照片，細(xì)胞核采用Hoechst33342染色；(b) SKOV-3細(xì)胞提前采用與Cy5.5標(biāo)記的ZHER2:342親和體預(yù)孵育1h后采用Cy5.5標(biāo)記的Z-M ADCN共孵育4h后的CLSM照片；(c) MDA-MB-231細(xì)胞與Cy5.5標(biāo)記的Z-M ADCN共預(yù)孵育4h后的CLSM照片；(d, e, f) MMAE及Z-M-ADCN在SKOV-3, BT474和MDA-MB-231細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性測(cè)定；(g) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MMAE及A-M-ADCN與SKOV-3細(xì)胞共孵育后的細(xì)胞凋亡率。

III?Z-M ADCN體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及分布

親和體分子因其分子量較小，容易在體內(nèi)清除。相較于親和體，自組裝形成的Z-M ADCN具有一定的納米尺寸，有利于延長在體內(nèi)的血液循環(huán)時(shí)間?；诖耍覀儾捎肧D大鼠研究Z-M ADCN在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)情況。結(jié)果表明Z-MADCN在體內(nèi)的清除速率明顯降低，其體內(nèi)半衰期明顯長于ZHER2:342親和體在體內(nèi)的半衰期。進(jìn)一步地，在近紅外熒光成像中顯示Cy5.5標(biāo)記的Z-M ADCN更容易在腫瘤部位富集，且在腫瘤部位滯留時(shí)間明顯增長。這些結(jié)果證明Z-M ADCN具有巨大的靶向治療潛力。

圖3. Z-M ADCN在SKOV-3荷瘤小鼠體內(nèi)的分布情況。(a) Cy5.5標(biāo)記的ZHER2:342親和體和Cy5.5標(biāo)記的Z-M ADCN在SD大鼠血漿中濃度隨時(shí)間的變化情況；(b) Cy5.5標(biāo)記的ZHER2:342親和體和Cy5.5標(biāo)記的Z-M ADCN在裸鼠體內(nèi)不同時(shí)間(1 h, 2 h, 4 h, 8 h)的近紅外熒光成像片照片；(c) Z-M ADCN在體內(nèi)不同時(shí)間(1 h, 4 h, 8 h)的組織分布情況。

IV?Z-M ADCN在SKOV-3及BT474荷瘤小鼠中的抗腫瘤性能

基于以上Z-M ADCN在體內(nèi)的靶向性能，作者研究了Z-M ADCN在SKOV-3和BT474為腫瘤模型的荷瘤小鼠中的抗腫瘤性能。結(jié)果表明：Z-M ADCN在SKOV-3和BT474荷瘤小鼠中均獲得優(yōu)異的抗腫瘤作用。在100 mm3的的腫瘤，小鼠給藥五次之后，腫瘤基本消失且小鼠體重保持不變。除此之外，Z-M ADCN對(duì)500 mm3以上的腫瘤也具有很好的治療效果，在連續(xù)給藥五次后，小鼠腫瘤均可以消除。相較于MMAE組，Z-M ADCN治療組具有更好的治療效果和更高的生物安全性。

圖4.?Z-M ADCN對(duì)SKOV-3腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤效果。(a) Z-M ADCN對(duì)對(duì)腫瘤體積為100 mm3 SKOV-3荷瘤小鼠的治療過程；(b, c) SKOV-3荷瘤小鼠治療過程中體積及體重的變化曲線圖；(d, e, f) Z-M ADCN治療結(jié)束后的種瘤體重，治療結(jié)束后小鼠照片及腫瘤照片；(g, h, i) Z-M ADCN對(duì)對(duì)腫瘤體積為500 mm3 SKOV-3荷瘤小鼠的治療及給藥后腫瘤體積和體重的變化曲線；(j, k, l) 治療結(jié)束后的腫瘤質(zhì)量，治療過程中小鼠照片及治療結(jié)束后各組腫瘤組織的H&E染色照片。

圖5.?Z-M ADCN對(duì)BT474腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤效果。(a) Z-M ADCN對(duì)對(duì)腫瘤體積為100 mm3?BT474荷瘤小鼠的治療過程；(b, c) BT474荷瘤小鼠治療過程中體積及體重的變化曲線圖；(d, e) Z-M ADCN 治療結(jié)束后的種瘤體重，治療結(jié)束后小鼠照片；(f, g, h) Z-M ADCN對(duì)對(duì)腫瘤體積為500 mm3?BT474荷瘤小鼠的治療及給藥后腫瘤體積和體重的變化曲線；?(i, j, k) 治療結(jié)束后的腫瘤質(zhì)量，小鼠照片及H&E染色照片。

作者簡介

夏雪霖

本文第一作者

上海交通大學(xué) 博士研究生

▍主要研究領(lǐng)域

靶向蛋白-藥物偶聯(lián)物納米藥物的制備研究。

夏小霞

本文通訊作者

上海交通大學(xué) 教授

▍主要研究領(lǐng)域

蛋白材料合成生物學(xué)研究。

▍主要研究成果

通過肽段模塊的挖掘及重構(gòu)，仿生及再設(shè)計(jì)人工蛋白質(zhì)，在宿主微生物體內(nèi)構(gòu)建亞細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)進(jìn)行代謝重塑；在體外制備智能仿生及生物醫(yī)用材料。在Nat Chem Biol等高水平期刊發(fā)表論文60余篇。

▍Email:?xiaoxiaxia@sjtu.edu.cn

顏德岳

本文通訊作者

上海交通大學(xué) 教授

▍主要研究領(lǐng)域

超分子自組裝和抗腫瘤新藥研制。

▍主要研究成果

中國科學(xué)院院士，上海交通大學(xué)講座教授，高分子科學(xué)家。比較系統(tǒng)地發(fā)展了聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的非穩(wěn)態(tài)理論，在超支化聚合物的可控合成、超分子自組裝和抗腫瘤新藥研制方面取得了原創(chuàng)性成果。已經(jīng)發(fā)表論文500余篇，連續(xù)多年被Elsevier評(píng)為中國高被引學(xué)者。獲國家自然科學(xué)獎(jiǎng)三項(xiàng)，何梁何利科技進(jìn)步獎(jiǎng)一項(xiàng)，國家教學(xué)成果獎(jiǎng)一項(xiàng)。

▍Email:?dyyan@sjtu.edu.cn

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