DiBAC4(3)? 是一種緩慢響應(yīng)的電位敏感型熒光探針,DiBAC4(3)? 可以進(jìn)入去極化細(xì)胞，并與胞內(nèi)的蛋白或膜進(jìn)行結(jié)合，發(fā)出增強(qiáng)的熒光和紅色光譜遷移。熒光波長：λex=490 nm，λem=505 nm)。DiBAC4(3) 增強(qiáng)去極化效果，可增加陰離子染料通量進(jìn)而提升熒光強(qiáng)度。而超極化則表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度下降。

DiBAC4(3) 使用方法：

可以使用DMSO、無水乙醇和純水溶解，用DMSO溶解成10mM的母液儲(chǔ)存，如果低濃度也可以滿足要求也可用純水溶解。

一、 用熒光顯微鏡測(cè)定膜電位的方法

（a）試劑

※ DiBAC4(3)

※ Dulbecco’s MEM (DMEM)

※ FBS (fetal bovine serum)

（b）方法

1) 將消化好的細(xì)胞移至DMEM中。

2) 加入FBS，控制濃度范圍在：2～15% 。

3) 加入DiBAC4(3)，控制濃度范圍在：1～5 μmol/L。

4) 用熒光顯微鏡觀察刺激后熒光強(qiáng)度的變化。[Ar激光(488 nm) 的激光共聚焦顯微鏡]，由于DiBAC4(3)的熒光會(huì)隨溫度變化而改變，所以必須在37℃的條件下測(cè)定。由于細(xì)胞膜的電位會(huì)變化，可以觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化。?

二. 用酶標(biāo)儀測(cè)定膜電位的方法

（a）試劑

※ DiBAC4(3)

檢測(cè)用緩沖液 (pH7.4; 20 mmol/L HEPES, 120 mmol/L NaCl, 2 mmol/L KCl, 2 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2,5 mmol/L glucose

（b）方法

1) 培養(yǎng)細(xì)胞：在微孔板中培養(yǎng)細(xì)胞

2) 清洗細(xì)胞：用含5 μmol/L DiBAC4(3) 的檢測(cè)用緩沖液200 μL，清洗微孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞2次

3) 染色：在孔板中加入180 μL含5 μmol/L DiBAC4(3) 的檢測(cè)用緩沖液，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。

4) 測(cè)定：用熒光酶標(biāo)儀觀察刺激后熒光強(qiáng)度的變化。由于DiBAC4(3)的熒光會(huì)隨溫度變化而改變，所以必須在37℃的條件下測(cè)定，加入20 μL含DiBAC4(3) 的檢測(cè)用緩沖液，每隔30秒測(cè)定1次熒光變化。?

三. 膜電位的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（a）原理

膜電位變化時(shí)色素的分布也隨之變化，所以熒光和吸收也會(huì)變化。這種變化程度取決于色素的分子數(shù)和細(xì)胞數(shù)的比率、色素的濃度以及細(xì)胞的種類。膜電位的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過用電極直接測(cè)定目的細(xì)胞的膜電位，在該電位所測(cè)得的熒光和吸收強(qiáng)度而制得的。?

（b）試劑

※ DiBAC4(3)

※ Eagle-Dulbecco medium

※ PBS

?c）方法

1) 用Eagle-Dulbecco medium培養(yǎng)細(xì)胞。

2) 取PBS中的細(xì)胞在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育30～60分鐘，然后改變孵育時(shí)間，制備不一樣的CO2濃度的樣品。

3) 加入DiBAC4(3)，終濃度為2 μmol/L。

4) 20分鐘后，在517 nm測(cè)定各個(gè)濃度的熒光強(qiáng)度，并用電極直接測(cè)定此時(shí)的電位差。

5) 用熒光強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的電位差來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。?

6) 其他方法

有鉀擴(kuò)散電位和熒光或吸收強(qiáng)度比較的方法。纈氨霉素引起鉀擴(kuò)散電位，鉀擴(kuò)散電位 (V) 是按照Nernst 方程計(jì)算如下：

V= -RT／F log[K+]in／[K+]out = -59 log[K+]in／[K+]out (mV)?

所以在纈氨霉素存在時(shí)，通過改變細(xì)胞外鉀離子濃度和細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度，計(jì)算擴(kuò)散電位，測(cè)定各個(gè)電位的熒光或吸收強(qiáng)度，比較后可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。