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PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間 一般為 48 h 以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于 48 h 后帶型不規(guī)則甚致消失。?

假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶?

PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR 循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng) 針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。?

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有 Taq 酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組 蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶， 極有可 能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘 加 Taq 酶或溴乙錠。?

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR 失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。 有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為： ①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看 OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引 23 物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR 有可能失敗，應(yīng)和 引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存， 防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二 聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對 PCR 擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR 擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影 響PCR 擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。?

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增采用的體積為 20ul、30ul、50ul?；?100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如 20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失 敗。

物理原因：變性對PCR 擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低， 可 致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR 擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo) 準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR 失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ) 序列，其PCR 擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

假陽性出現(xiàn)的PCR 擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物為非 目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。?

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：

一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種 假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物 質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試 劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫?相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR 產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR 方法來減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR 擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

非特異性條帶 的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低， 及 PCR 循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。

其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶 量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量， 適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。

適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR 擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP 濃度過高， Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少 dNTP 的 濃度。適當(dāng)降低 Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。