提醒：本篇文章較長(zhǎng)，且對(duì)于部分人較為難懂，但文章內(nèi)核非常優(yōu)秀，建議學(xué)生黨、愛(ài)好者或相關(guān)專(zhuān)業(yè)的人深入閱讀。

一.常見(jiàn)的化學(xué)動(dòng)力學(xué)方程

在討論酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)之前，我先帶領(lǐng)大家先復(fù)習(xí)一下化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的幾種常見(jiàn)情況。

1. 一級(jí)反應(yīng)

一級(jí)反應(yīng)是指反應(yīng)速度只與反應(yīng)物濃度的一次方成正比的反應(yīng)。

即下圖所示：

因此，該化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程可表示為：

由一級(jí)反應(yīng)的定義可得：

因此可得：

移項(xiàng)得：

解得：

2. 二級(jí)反應(yīng)

在二級(jí)反應(yīng)中，反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的二次方成正比，比較典型的形式為

對(duì)于反應(yīng)：

經(jīng)分析，對(duì)于反應(yīng)過(guò)程中任意一刻，有：

動(dòng)力學(xué)方程為：

聯(lián)立可得：

解得：

對(duì)于反應(yīng)：

則有兩種情況。當(dāng)反應(yīng)物A和反應(yīng)物B初始濃度相同時(shí)，則推導(dǎo)方法與上述過(guò)程基本類(lèi)似，可得其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

當(dāng)反應(yīng)物A和B的起始濃度不同時(shí)，可得：

所以：

當(dāng)反應(yīng)級(jí)數(shù)為大于等于3的整數(shù)時(shí)，其動(dòng)力學(xué)方程的推導(dǎo)過(guò)程整體與簡(jiǎn)單的二級(jí)反應(yīng)的推導(dǎo)過(guò)程類(lèi)似。

3. 零級(jí)反應(yīng)

零級(jí)反應(yīng)的特征為反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)（即零次冪相關(guān)），為常數(shù)。零級(jí)反應(yīng)較少，一些發(fā)生在固體表面上的反應(yīng)屬于零級(jí)反應(yīng)。如氨在鎢、鐵等催化劑表面上的分解反應(yīng)。

這是由于當(dāng)反應(yīng)物分子吸附于固體催化劑表面進(jìn)行反應(yīng)且濃度足夠大，催化劑表面被反應(yīng)物分子完全覆蓋時(shí)，其反應(yīng)速率只與催化劑的表面積有關(guān)而與反應(yīng)物分子本身濃度無(wú)關(guān)。

動(dòng)力學(xué)方程可寫(xiě)為：

復(fù)習(xí)完了基礎(chǔ)的化學(xué)動(dòng)力學(xué)方程，那就言歸正傳，回到酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的主題上。

二.中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)的提出與米氏方程的導(dǎo)出

長(zhǎng)久以來(lái)，人們?cè)谏鐣?huì)生產(chǎn)實(shí)踐中逐漸認(rèn)識(shí)到化學(xué)反應(yīng)的速率隨著反應(yīng)物濃度的提升而加快。1903年，巴黎索邦大學(xué)的Victor Henri在用蔗糖酶水解蔗糖的實(shí)驗(yàn)中，在固定了蔗糖酶濃度，改變蔗糖濃度對(duì)酶的影響時(shí)，觀察到二者的關(guān)系呈現(xiàn)矩形雙曲線型，即我們?cè)诟咧姓n本上見(jiàn)到的那張經(jīng)典的圖示：

由圖像可知：在底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。此時(shí)即出現(xiàn)了酶的底物飽和現(xiàn)象。所有酶都有飽和現(xiàn)象，只是飽和時(shí)所需的底物濃度不同而已。

借由實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Henri做出了一個(gè)假設(shè)，他認(rèn)為在酶催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)由酶和底物分子結(jié)合形成的不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物。這個(gè)中間產(chǎn)物不僅容易生成，而且容易分解出產(chǎn)物，釋放出原來(lái)的酶。此即著名的中間絡(luò)合物假說(shuō)。同時(shí)Henri針對(duì)蔗糖酶的轉(zhuǎn)化反應(yīng)提出了一個(gè)初步的公式：

其中K、Φ、m、n均為常數(shù)，v為反應(yīng)速率，[S]為底物濃度，[P]為產(chǎn)物濃度

以現(xiàn)在的觀點(diǎn)來(lái)看，該方程表明酶促反應(yīng)受到底物的抑制，為典型的有抑制劑下的酶促反應(yīng)。

1913年，Michaelis L.和Menten M.重新考察了Henri的研究結(jié)果，在中間絡(luò)合物假說(shuō)的基礎(chǔ)上考慮快速平衡過(guò)程并重新推到了其數(shù)學(xué)表達(dá)式并將有關(guān)結(jié)果發(fā)表在與《Biochemische Zeitschrift》（《生物化學(xué)雜志》，即《FEBS ?Journal》的前身）。

二人根據(jù)中間絡(luò)合物假說(shuō)提出了單底物酶促反應(yīng)的快速平衡模型，其反應(yīng)過(guò)程可表示如下：

其中E表示游離狀態(tài)下的酶，而S為反應(yīng)底物，ES為不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，P為產(chǎn)物。

二人在此基礎(chǔ)上，提出了單底物不可逆酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程，即著名的Michaelis-Menten方程（米氏方程）。

其中V0為酶促反應(yīng)的初速度，Vmax為酶促反應(yīng)的最大速度，[S]為底物濃度，而Ks為解離常數(shù)，即K2/K1

米氏方程的推導(dǎo)建立在三個(gè)基本假設(shè)上：

（1）在反應(yīng)開(kāi)始初期，產(chǎn)物的生成量極少，逆反應(yīng)可不予考慮；

（2）底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離酶的濃度，因此在反應(yīng)過(guò)程中底物濃度基本上保持恒定；

（3）反應(yīng)的第二步為反應(yīng)的限速步驟，即K2 ? K3，以保證 ES 分解為 P 的速率不足以破壞 E 和 ES 之間的平衡。

其推導(dǎo)過(guò)程如下：

假定 E + S → ES 可迅速建立平衡，且反應(yīng)的第二步相比第一步要慢得多，因此，該反應(yīng)的整體反應(yīng)速率由第二步?jīng)Q定，即：

由于[ES]不穩(wěn)定且濃度小的特性，在實(shí)驗(yàn)上不易測(cè)量，因此可通過(guò)其他易測(cè)量的參數(shù)來(lái)表示。因此，利用第一步快速平衡中的ES解離為E和S的反應(yīng)常數(shù)：

則有：

由于在反應(yīng)過(guò)程中酶的總量處于恒定，由此寫(xiě)出酶守恒公式：

因此：

將上式代入至

中，得：

整理得：

將

代入上式，得：

因?yàn)榉磻?yīng)過(guò)程中的最大速率即為當(dāng)所有的酶均與底物結(jié)合參與反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)速率，因此有

代入得：

盡管該模型在解釋酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)理上取得了重大的突破，但其假設(shè)仍有不完美之處。尤其是沒(méi)有理由認(rèn)為所有酶促反應(yīng)中均有K2 ? K3以及不考慮第二步中存在可逆反應(yīng)的可能性。因此1925年，Briggs G.E.和Haldane J. B. S. 對(duì)米-曼氏模型進(jìn)行修正，提出了酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)理論。

在穩(wěn)態(tài)理論中，Briggs提出以下假設(shè)：

（1）在反應(yīng)開(kāi)始的初期，由于產(chǎn)物濃度極低，因此第二步中 E + S → ES 的速率極低，該步驟可忽略不計(jì)；

（2）反應(yīng)起始時(shí)，底物濃度遠(yuǎn)大于酶濃度，底物濃度可近似認(rèn)為在反應(yīng)初期保持恒定；

（3）當(dāng)反應(yīng)開(kāi)始后，經(jīng)過(guò)一個(gè)極短的時(shí)間（幾毫秒）后，ES濃度達(dá)到一個(gè)基本恒定的狀態(tài)。在一定時(shí)間內(nèi)，盡管S和P的濃度不斷變化，但ES的生成速率 vf 和分解速率 vd 基本上相等，ES凈生成速率基本保持為0。

數(shù)學(xué)推導(dǎo)如下：

酶-底物復(fù)合物ES的生成速率?vf?可表示為：

ES的分解速率?vd?可表示為：

當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)態(tài)時(shí)，ES的濃度保持恒定，vf?=?vd，即：

由酶的恒等式

可知：

代入得：

整理得：

令：

則有：

解[ES]得：

代入到

中，得：

從形式上來(lái)看，由穩(wěn)態(tài)平衡模型和快速平衡模型推導(dǎo)出的式子具有相同的數(shù)學(xué)形式，但前者相比于后者有著更高的普遍性。為了紀(jì)念Michaelis和Menten兩人，人們以上兩個(gè)式子均稱(chēng)為米氏方程，而Km則被稱(chēng)為米氏常數(shù)。

現(xiàn)在我們?cè)倩乜从蒆enri做出來(lái)的那張圖。

通過(guò)簡(jiǎn)單的計(jì)算，我們可以發(fā)現(xiàn)：

反應(yīng)速率與底物濃度的一次方成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。

反應(yīng)速率為常數(shù)，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。

而當(dāng)?shù)孜餄舛冉橛谶@0.01Km和100Km之間時(shí)，則反應(yīng)速率符合米氏方程，為混合級(jí)反應(yīng)。

這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

且當(dāng)[S] =?Km時(shí)，

我們不難看出米氏常數(shù)的物理意義便是當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。

三.有關(guān)米氏常數(shù)

除此之外，米氏常數(shù)還可以顯示出其他一些物理含義，例如：

（1）作為酶學(xué)研究中的重要研究數(shù)據(jù)，從米氏常數(shù)Km的推導(dǎo)中：

我們可以發(fā)現(xiàn)，在其表達(dá)式中，所有的數(shù)據(jù)對(duì)于在已確定條件的下的某一種酶均為已確定的常數(shù)，因此在指定條件下，米氏常數(shù)有確定值。米氏常數(shù)為酶的特征常數(shù)之一，只與酶本身的性質(zhì)及底物種類(lèi)有關(guān)而與酶的濃度無(wú)關(guān)，且對(duì)于不同的酶，其Km不同。

（2）對(duì)于一些專(zhuān)一性不強(qiáng)的酶來(lái)說(shuō)，有幾種不同的底物，則就有幾個(gè)不同的值。而其中最小值對(duì)應(yīng)的底物則是該酶的最適底物。如對(duì)于胰凝乳蛋白酶來(lái)說(shuō)，苯甲酰酪氨酰胺就是其最適的底物

至于怎么理解？因?yàn)镵m對(duì)應(yīng)數(shù)值是使酶促反應(yīng)達(dá)到最大速率一半的底物濃度，那么，Km越小，說(shuō)明底物就更容易使酶飽和，對(duì)于底物單位濃度的變化反應(yīng)速率上升的更快，即 v 對(duì) Δs 更加敏感。

另外，當(dāng)我們對(duì)米氏方程的推導(dǎo)過(guò)程中的兩種模型進(jìn)行仔細(xì)比對(duì)后，同樣可以發(fā)現(xiàn)一些有意思的事情。

對(duì)于這樣一個(gè)反應(yīng)：

在快速平衡模型中，平衡常數(shù)Ks的表達(dá)式為：

而在穩(wěn)態(tài)模型中，米氏常數(shù)Km的表達(dá)式為：

將二式比對(duì)，可以觀察到：

當(dāng)k1 ? k2時(shí)，即 ES → P + E 為整個(gè)反應(yīng)中極慢的一步，則有：

所以，快速平衡模型實(shí)際上是穩(wěn)態(tài)平衡模型的一種特殊情況，即當(dāng) ES → P + E 極慢（k2/k1極?。r(shí)，穩(wěn)態(tài)平衡基本上等同于快速平衡。從另一個(gè)角度看，穩(wěn)態(tài)平衡實(shí)質(zhì)上是在快速平衡的基礎(chǔ)上建立一個(gè)慢速平衡，即：穩(wěn)態(tài)平衡=快速平衡+慢速平衡。

四.米氏常數(shù)的線性化

米氏方程作為酶學(xué)上表示酶促反應(yīng)速率和底物起始濃度之間關(guān)系的方程，是描述生物化學(xué)中酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的經(jīng)典方程。然而由于其圖線為雙曲線型，其圖像擬合過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，對(duì)于該問(wèn)題，一個(gè)比較便捷的解決方法便是將原有方程變形使其能夠以線性形式表達(dá)。常用的線性化方法有：Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法、Eadie-Hofstee作圖法、Hanes-Woolf作圖法以及Eisenthal作圖法。其中應(yīng)用最為廣泛的為L(zhǎng)ineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。

Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法又被稱(chēng)為萊恩威弗-伯克作圖，由Hans Lineweaver和Dean burk于1934年提出。其基本形式為將米氏方程等式兩邊取倒數(shù)后變形而成：

該作圖方法可以較為直觀的得到米氏方程中兩個(gè)重要參量和。同時(shí)也可應(yīng)用于存在抑制現(xiàn)象的酶促反應(yīng)過(guò)程。但其不足在于實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過(guò)分的集中于直線的左下方，而在低濃度區(qū)域的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)又因倒數(shù)后誤差較大，往往偏離直線較遠(yuǎn)，從而影響和的準(zhǔn)確測(cè)定。此時(shí)，可用Eadie-Hoffstee法或者Hanes-Woolf法彌補(bǔ)在底物濃度過(guò)小或過(guò)大區(qū)域Lineweaver-Burk法誤差大的缺點(diǎn)。

五.可逆抑制條件下的米氏方程

抑制作用是指抑制劑通過(guò)作用于酶的必需基團(tuán)從而在不使酶變性的基礎(chǔ)上降低酶的活性甚至使酶喪失活性。相較于酶的變性，盡管二者的作用效果相似，但從機(jī)理上有著本質(zhì)上的區(qū)別。變性過(guò)程中，維系酶正常構(gòu)象的的次級(jí)鍵（氫鍵、疏水作用、范德華力等，有時(shí)也包括二硫鍵的打開(kāi)）遭到破壞而失去三維結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致正常生物學(xué)活性的喪失；而抑制作用只針對(duì)于特定的反應(yīng)基團(tuán)，例如，二異苯基磷酰氟可作用于蛋白酶及酯酶活性中心色氨酸的羥基形成磷酯鍵從而阻礙正常生物學(xué)的實(shí)現(xiàn)；而有機(jī)汞化合物、含鹵素的烷化物可作用于巰基等。

在這個(gè)過(guò)程中，酶分子的空間結(jié)構(gòu)與次級(jí)鍵不受破壞而只有特定的功能基團(tuán)被修飾而因此酶活的降低。

從抑制劑與酶蛋白中功能基團(tuán)結(jié)合的緊密程度而言，抑制類(lèi)型可分為不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。而在可逆的抑制作用中，根據(jù)其作用機(jī)理，可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制與反競(jìng)爭(zhēng)性抑制三種類(lèi)型。

（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制

恰如名字所示，競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征就在于“競(jìng)爭(zhēng)”二字。這類(lèi)抑制作用通過(guò)抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，與游離的酶可逆地形成抑制劑-酶復(fù)合物，占據(jù)酶的反應(yīng)活性位點(diǎn)從而阻止酶與底物的結(jié)合以降低酶的反應(yīng)速率。

在此種抑制作用中，抑制劑具有與底物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)（例如丙二酸可與琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)琥珀酸脫氫酶的反應(yīng)位點(diǎn)），可被酶錯(cuò)誤的識(shí)別為底物并結(jié)合或者產(chǎn)生空間位阻而阻止底物的正常結(jié)合。被抑制劑結(jié)合的酶既無(wú)法再結(jié)合正確的底物，也無(wú)法進(jìn)行正常的酶促反應(yīng)。實(shí)際上降低了酶的有效濃度。在宏觀上的表現(xiàn)便是酶的活性受到了抑制。

琥珀酸，又名丁二酸、1，2-乙烷二甲酸，分子式C4H6O4?？稍阽晁崦摎涿缸饔孟律裳雍魉帷?/p>

由于競(jìng)爭(zhēng)性抑制可認(rèn)為是對(duì)于酶E同時(shí)發(fā)生了

兩個(gè)平行反應(yīng)。因此，根據(jù)化學(xué)平衡的知識(shí)可知，當(dāng)增大底物S的濃度時(shí)，反應(yīng)

平衡將會(huì)右移，而反應(yīng)

將會(huì)受到抑制。因此，可通過(guò)增大底物S的濃度來(lái)解除抑制劑I的抑制作用。

其動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo)如下：

將

并代入 Ki 的表達(dá)式中，得：

由米氏假說(shuō)得：

代入酶守恒式

得：

代入

得：

變形得：

從數(shù)學(xué)上分析，競(jìng)爭(zhēng)性抑制的抑制程度與抑制物 I 的濃度成正比，與底物S的濃度成反比；當(dāng)[I]和[S]為定值時(shí)，Ki越小、Km越大，抑制作用越強(qiáng)。

從Lineweaver-Burk圖上我們可以看出，競(jìng)爭(zhēng)性抑制的一個(gè)最典型的動(dòng)力學(xué)特征便是酶促反應(yīng)的最大速率vmax不變，而米氏常數(shù)Km變大。

（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，引起酶分子的構(gòu)象變化使之不能催化底物形成產(chǎn)物。非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，又可以與底物-酶復(fù)合物結(jié)合形成 EIS 三元復(fù)合物。抑制劑的結(jié)合不影響酶與底物的結(jié)合，但會(huì)阻止酶-底物復(fù)合物進(jìn)一步反應(yīng)生成產(chǎn)物，因此酶活性降低。一些重金屬離子如Cu2+、Pb2+、Hg2+的抑制作用即屬于此類(lèi)

由

得：

同理，由

得：

由

解得：

將以上結(jié)果代入到：

整理得：

雙倒數(shù)方程為：

從非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的米氏方程來(lái)看，其抑制程度只取決于抑制劑濃度 [I] 和 Ki有關(guān)，而與底物濃度 [S] 與底物的米氏常數(shù)Km無(wú)關(guān)。從圖像上可明顯看出，在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，米氏常數(shù)Km保持不變，

（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制

與競(jìng)爭(zhēng)性抑制恰好相反，在反競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑只能與酶-底物二元復(fù)合物結(jié)合，形成的三元復(fù)合物無(wú)法釋放出產(chǎn)物。宏觀表現(xiàn)為酶的有效濃度降低，酶活力減少。常見(jiàn)于多底物的酶促反應(yīng)過(guò)程中。

動(dòng)力學(xué)方程為：

雙倒數(shù)方程為：

其推導(dǎo)過(guò)程與競(jìng)爭(zhēng)性抑制相似，本處不做贅述。

反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)特征為vmax、Km等比例減小，在圖像上表現(xiàn)為一組平行的直線。其抑制程度決定于Ki、Km、[S]、[I]。既與[S]成正比，也與[I]成正比；在[I]、[S]一定時(shí)，Ki越大，抑制程度越??；Km越大，抑制程度越小。

PS：本文未經(jīng)作者授權(quán)禁止轉(zhuǎn)載、摘抄

作者：極地冰川

審核：未名

A.P.C.編輯部科普組