RNA干擾

（RNAi）是一種進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制，它是由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)同源mRNA高效特異性降解從而抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，是研究基因功能常用的手段之一。用于誘導(dǎo)持續(xù)的RNAi的手段，是用pol III型啟動(dòng)子表達(dá)shRNA，常用的pol III型啟動(dòng)子有U6和H1，由于構(gòu)建序列較短，shRNA能夠輕易地插入病毒載體，但是要想實(shí)現(xiàn)特定組織中的基因沉默，幾乎少不了組織特異性啟動(dòng)子的助力，然而U6和H1并不具有組織特異性，顯然無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，有什么方法可以解決這個(gè)問題呢？答案就是利用miR30結(jié)構(gòu)。本期小編將從基于miR30的shRNA、miR30結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)、案例分析三個(gè)方面為大家介紹用于組織特異性干擾的有力輔助工具—miR30結(jié)構(gòu)。

01基于miR30結(jié)構(gòu)的shRNA介紹

首先，我們先簡(jiǎn)單了解下miRNA的成熟過程：

• 初級(jí)miRNA（pri-miRNA）在核內(nèi)被Drosha/ DGCR8復(fù)合物識(shí)別并加工成前體miRNA（pre-miRNA）

• pre-miRNA通過Exprotin-5復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶剪切，最終形成成熟的雙鏈miRNA

  miRNA和shRNA的成熟依賴于非常相似的細(xì)胞機(jī)制，只是miRNA多了一步核內(nèi)的加工過程（見圖1），這一發(fā)現(xiàn)打開了使用前體miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)作為生產(chǎn)siRNA骨架的大門，這種方法可以使shRNA以更自然的方式進(jìn)行加工剪切（見圖2），最大限度地減少不必要的副作用，而且插入miRNA骨架的shRNA序列更長(zhǎng)，因此可由pol II型啟動(dòng)子（包括多種組織特異性啟動(dòng)子）驅(qū)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)特定組織中的基因沉默。目前用于干擾作用的miRNA骨架（如miR30、miR155、miR17-92等）中，最常用的就是miR30結(jié)構(gòu)。
  

圖1. shRNA和miRNA成熟和作用機(jī)制[1]

? 圖2. 基于miR30結(jié)構(gòu)的shRNA加工途徑[2]

在已知miRNA和shRNA作用原理的情況下，研究者們將天然miR30A的主要的部件替換，形成了人工合成的miR30結(jié)構(gòu)。那么和天然的miR30A相比，改造的miR30主要有哪些不同呢？

圖3. 天然miR30A與工具miR30結(jié)構(gòu)的區(qū)別[3]

如上圖3所示，和天然miR30A相比，工具miR30結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)為：

1. Guide部分在反向鏈上，且莖環(huán)沒有凸起

2. 為設(shè)計(jì)shRNA 3’端的垂懸堿基，Loop部分的兩個(gè)保守堿基對(duì)由CU/GG變?yōu)閁A/UA

3. 兩側(cè)引入了XhoI/EcoRI酶切位點(diǎn)，以便克隆

經(jīng)過不斷的優(yōu)化和測(cè)試，形成了如今使用較為成熟的工具miR30結(jié)構(gòu)。相信看到這里的小伙伴們對(duì)miR30結(jié)構(gòu)有了更深入的了解，那么shRNA具體怎么構(gòu)建到miR30骨架中的呢？

具體構(gòu)建方案為：將miR30的5'flanking region和3'flanking region以及l(fā)oop序列保留，然后將其成熟區(qū)域的序列替換成靶點(diǎn)序列，示意圖如下：

圖4. 基于miR30結(jié)構(gòu)的shRNA載體

02Mir30干擾結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)分析

（1）啟動(dòng)子選擇性多：基于miR30的shRNA可以通過多種pol II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，包括CMV、CAG、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子等，尤其是組織特異性啟動(dòng)子，在這類啟動(dòng)子的作用下，利用miR30結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的基因敲低往往只限于某些特定的組織或器官，同時(shí)表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。漢恒生物為科研工作者提供近50種特異性啟動(dòng)子，能夠?qū)崿F(xiàn)不同組織/細(xì)胞的特異性表達(dá)，以下是漢恒生物的特異性啟動(dòng)子現(xiàn)貨庫(kù)列表：

表1. 漢恒生物組織/細(xì)胞特異性啟動(dòng)子現(xiàn)貨庫(kù)列表

（2）實(shí)現(xiàn)多個(gè)shRNA共表達(dá)：由于pol II型啟動(dòng)子可以啟動(dòng)較大的基因轉(zhuǎn)錄，因此多個(gè)shRNA可由單個(gè)pol II型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)；

（3）基于miR30結(jié)構(gòu)的shRNA不太容易通過干擾內(nèi)源性miRNA途徑引起細(xì)胞毒性[3]；

（4）miR30的天然環(huán)狀結(jié)構(gòu)能確保精確的Dicer切割并減少脫靶效應(yīng)[3]。

03漢恒客戶Mir30干擾經(jīng)典案例分享

案例1-肝臟特異性敲低

文章標(biāo)題：G protein-coupled receptor 35 attenuates nonalcoholic steatohepatitis by reprogramming cholesterol homeostasis in hepatocytes

雜志：《Acta Pharmaceutica Sinica B》（IF=14.5）

合作客戶：安徽醫(yī)科大學(xué) 王華教授和王學(xué)富副教授團(tuán)隊(duì)

使用病毒：AAV8-TBG-miR30-shRNA(Stard4)-mcherry

使用方法：尾靜脈注射，1 × 1011 vg/mouse 。

圖5. AAV特異性敲低肝臟中的Stard4[4]

文章鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36970193/

案例2-神經(jīng)元特異性敲低

文章標(biāo)題：Hyperactive neuronal autophagy depletes BDNF and ?impairs adult hippocampal neurogenesis in a corticosterone-induced mouse model of depression

雜志：《Theranostics》（IF=12.4）

合作客戶：沈陽藥科大學(xué) 吳春福教授團(tuán)隊(duì)

使用病毒：AAV-hSyn-miR30-shRNA(Atg5)

使用方法：腦立體定位注射，以0.2μL/min的速率分別注射到DG的兩側(cè)（1μL/側(cè)）。

圖6. AAV特異性敲低神經(jīng)元中的Atg5[5]

文章鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36793868/

案例3-肺巨噬細(xì)胞特異性敲低

文章標(biāo)題：NLRC3 Expression in Macrophage Impairs Glycolysis and Host Immune Defence by Modulating the NF-?B-NFAT5 Complex During Sepsis-induced Immunosuppression

雜志：《Molecular Therapy》（IF=12.9）

合作客戶：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 尚游教授團(tuán)隊(duì)

使用病毒：AAV-SP146-miR30-shNLRC3-eGFP

使用方法：氣管內(nèi)注射，1 × 1011 vg/mouse。

圖7. 使用AAV特異性敲低肺巨噬細(xì)胞的NLRC3[6]

文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.08.023

由此可見，miR30結(jié)構(gòu)結(jié)合組織特異性啟動(dòng)子能夠有效實(shí)現(xiàn)特定組織/細(xì)胞的基因沉默！現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)、心臟、內(nèi)皮、肝臟等多個(gè)研究領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)

[1] Luke S Lambeth., Craig A Smith. Short hairpin RNA-mediated gene silencing. Methods Mol Biol. 2013; 942:205-32.

[2] Xavier Bofill-De Ros1 and Shuo Gu. Guidelines for the optimal design of miRNA-based shRNAs. Methods. 2016 July 1; 103: 157-166.

[3] Fellmann C., Hoffmann T., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports.?2013 Dec 26; 5(6):1704-13.

[4] Wei X., Fan Y., et al. G protein-coupled receptor 35 attenuates nonalcoholic steatohepatitis by reprogramming cholesterol homeostasis in hepatocytes.Acta Pharm Sin B. 2023 Mar; 13(3):1128-1144.

[5] Zhang K.,Wang F., et al. Hyperactive neuronal autophagy depletes BDNF and? impairs adult hippocampal neurogenesis in a corticosterone-induced mouse model of depression. Theranostics.2023 Jan 22; 13(3):1059-1075.

[6] Xu J., Gao C., et al. NLRC3 Expression in Macrophage Impairs Glycolysis and Host Immune Defence by Modulating the NF-?B-NFAT5 Complex During Sepsis-induced Immunosuppression. Mol Ther.?2023 Jan 4; 31(1):154-173.