Disulfidptosis classification of hepatocellular carcinoma reveals correlation with clinical prognosis and immune profile

結(jié)果

HCC 中 DRG 的遺傳概況

為了探索 DRG 在肝細胞癌中的作用，我們描述了它們的遺傳圖譜。TCGA隊列中的364例HCC患者（TCGA隊列中未提及其余患者的突變信息）中，有26例（7.14%）發(fā)生了二硫化物下垂基因相關(guān)突變的調(diào)控。FLNB和TLN1的突變頻率較高，而樣本中未發(fā)生SLC7A11等突變。9個基因的CNV擴增頻率高于缺失頻率，6個基因的CNV缺失頻率高于擴增頻率（。15 個 DRG 在染色體上的位置如所示。與正常組織相比，除 MYH10 和 IQGAP1 外的所有 DRG 在 HCC 中均上調(diào)。我們的研究還表明，13 個 DRG 的表達上調(diào)表明該 HCC 預(yù)后不良MYH10和IQGAP1在生存差異上沒有差異。這表明 DRG 在 HCC 患者預(yù)后中的作用。

基于二硫化物表型的 HCC 分類模式鑒定

為了探索 DRG 在 HCC 中的表達特征，使用基于 15DRG 表達數(shù)據(jù)的共識聚類算法對來自 TCCA-LIHC 和 ICGC-LIRI-JP 隊列的 602 個研究樣本進行了聚類。通過聚類分析得到兩個二硫化物簇A（253個樣本）和B（349個樣本）。PCA、tSNE和UMAP降維分析表明，An類和B類樣本明顯聚類。B 組患者在 Kaplan-Meier 曲線中的生存率優(yōu)于 A 組（HCC 患者信息缺失）。熱圖顯示 DRGs 在 A 亞型中比 B 亞型中表達更豐富。熱圖顯示 DRG 在 A 亞型中比 B 亞型中表達更豐富。

兩種二硫化物亞型之間的 TME 特征和免疫浸潤

為了闡明 TME 中兩種二硫化物亞型的特征，本研究計算了兩個簇之間的免疫評分和基因表達。與之前的看法相反，簇 A 在免疫評分、基質(zhì)評分和 ESTIMATE 評分方面高于簇 B。此外，大多數(shù)免疫細胞在 A 組中比在 B 組中更富集。其中，CD8+ T細胞、巨噬細胞、NK細胞、Treg 、APC共抑制、aDCs等免疫刺激因子在A亞型患者中均有顯著表達。這表明共刺激因子和共抑制因子可能在簇中發(fā)揮各自的作用A.?T細胞在免疫反應(yīng)中主要由兩種信號模式激活：MHC與T細胞受體的結(jié)合，分子信號的共刺激和共抑制。此外，我們分析了MHC相關(guān)基因的表達差異，共刺激/共抑制基因型之間的因子和免疫相關(guān)基因。大多數(shù)HLA家族基因在簇A中顯著上調(diào)。近年新發(fā)現(xiàn)的MICA和MICB的表達也是一致的，共刺激因子和共抑制因子也在簇 A 中顯示出表達優(yōu)勢因此，我們分析了高免疫浸潤和免疫抑制的聯(lián)合作用在 HCC 的腫瘤微環(huán)境中。

不同二硫化物亞型的生物學(xué)功能分析

應(yīng)用 GSVA 分析兩個簇的生物學(xué)行為。A組樣本主要富集了多種癌癥相關(guān)通路、免疫系統(tǒng)相關(guān)通路和細胞骨架蛋白相關(guān)通路。簇 B 富含生物合成相關(guān)途徑。為了進一步探索聚類 A 和 B 中各自基因富集的途徑相關(guān)性，我們使用了 GSEA 分析。簇 A 中的高表達基因富含細胞因子相互作用和ECM受體相互作用。低表達組基因集中于多種氨基酸代謝和膽汁酸生物合成。值得注意的是，B亞型中的高富集組富含多種氨基酸代謝、葉綠素代謝和膽汁酸生物合成。低富集組主要集中在細胞因子相互作用和ECM受體相互作用。細胞因子在腫瘤中發(fā)揮雙向作用。IL-18通過激活NF-κB促進血管生成，誘導(dǎo)癌細胞增殖和侵襲，防止細胞凋亡。IL-6 同樣促進慢性炎癥性癌變并推動內(nèi)在腫瘤進展。高劑量重組IL-2于1992年和1998年被FDA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌（RCC）和黑色素瘤， 分別。細胞外基質(zhì)（ECM）與多種腫瘤的進展有關(guān)，包括肝細胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌和乳腺癌。ECM 的硬化促進細胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、癌細胞轉(zhuǎn)移和耐藥性的發(fā)展。據(jù)報道，ECM 的硬化可促進腫瘤外泌體的釋放并激活 NORTH 通路以促進腫瘤侵襲。這兩種亞型的功能富集可能是導(dǎo)致患者預(yù)后差異的原因。

3.5?。二硫化物下垂預(yù)后模型的構(gòu)建和驗證

二硫化物下垂的分類在肝細胞癌（HCC）的臨床預(yù)后中具有很大的潛力。為了更好地了解二硫化物下垂的特征，我們構(gòu)建了一個預(yù)后模型。最初，我們從簇中識別出 681 個 DEG，并通過單變量 Cox 分析識別出 331 個預(yù)后相關(guān)基因。隨后，對331個預(yù)后基因進行Lasso-Cox回歸分析，最終鑒定出4個關(guān)鍵基因（表1）).?基于這些關(guān)鍵基因，我們構(gòu)建了二硫化物下垂的風(fēng)險評分。風(fēng)險評分=(-0.1806*APOC1) + (-0.2229*IL7R) + (0.0851*SPP1) + (0.2528MYBL2)。我們根據(jù)風(fēng)險評分將所有 HCC 樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。與低二硫化物下垂風(fēng)險組相比，高二硫化物下垂風(fēng)險組的預(yù)后明顯更差。測試組和訓(xùn)練組的 Kaplan-Meier 生存曲線證實。風(fēng)險曲線分析表明，增加風(fēng)險評分會增加他們的死亡風(fēng)險。風(fēng)險生存分析顯示高危患者死亡率增加，生存時間相對較短。此外，我們證實了二硫化物風(fēng)險評分在預(yù)測 1、3 和 5 年后的預(yù)后方面具有很高的準(zhǔn)確性。整個樣本的曲線下面積 (AUC) 值在 1、3 和 5 年時分別為 0.766、0.736 和 0.699。內(nèi)部訓(xùn)練集中的 AUC 值分別為 0.808（1 年）、0.749（3 年）和 0.757（5 年）。測試集中的 AUC 值在 1、3 和 5 年時分別為 0.716、0.704、0.637

最后，我們使用 GSE14520 作為外部獨立數(shù)據(jù)集來驗證二硫化物風(fēng)險評分的能力。我們對驗證組應(yīng)用了基于二硫鍵的風(fēng)險評分，并將其分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。已經(jīng)證明低風(fēng)險患者具有顯著的生存優(yōu)勢。更重要的是，ROC 曲線對驗證集隊列具有顯著的預(yù)后意義，1、3 和 5 年時的 AUC 值均高于 0.65?？偟膩碚f，我們的結(jié)果證明了二硫化物下垂風(fēng)險評分在評估預(yù)后方面的良好潛力。

3.6?。二硫化物風(fēng)險預(yù)后模型的獨立預(yù)測價值

我們構(gòu)建了一個二硫化物下垂風(fēng)險預(yù)后模型，證明了生存差異。為了進一步調(diào)查，我們整合了所有樣本的臨床信息，并確定了三個共同的臨床特征（年齡、性別、分期）。我們的分析表明分期和風(fēng)險評分是HCC 的預(yù)后因素。風(fēng)險評分和階段的 ROC 曲線顯示其在預(yù)測預(yù)后方面具有很高的準(zhǔn)確性。我們還發(fā)現(xiàn)，B 組的風(fēng)險顯著低于 A 組。桑基圖表明，低風(fēng)險組主要由屬于 B 亞型的患者組成，而大多數(shù)存活患者來自該組。相反，去世的患者具有更高的風(fēng)險評分并且主要來自亞型 A，這與之前的分析一致

為了進一步驗證我們的二硫鍵特征模型對 HCC 患者的適用性，我們將其與之前報道的模型進行了比較。在 TCGA-LIHC 隊列中，Tang 簽名[18]、Wang 簽名[19]、Zhang 簽名[20]和 Deng 簽名[21]均顯示出顯著的生存差異，P 值小于 0.01.?4 個 HCC 特征模型的 AUC 值在 3 年和 5 年時均大于 0.60。比較二硫化物特征模型與其他四種模型預(yù)測生存事件的能力，我們發(fā)現(xiàn)在五種特征模型的C-index值中，二硫化物特征模型的值最高，為0.708，更接近完美模型，其次是唐簽名（0.663），王簽名（0.657），鄧簽名（0.659）和張簽名（0.604）。此外，二硫化物特征模型的 RMS 值也是五個模型中最高的

3.7?。Disulfidptosis 風(fēng)險評分在預(yù)測腫瘤治療效果方面具有相當(dāng)大的潛力

在本研究中，我們分析了不同 HCC 風(fēng)險組之間的免疫浸潤比例（，發(fā)現(xiàn)高危組漿細胞浸潤更豐富。活化的樹突狀細胞（R = 0.33，P??= 0.018）與風(fēng)險評分呈正相關(guān)。CD8T 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、活化的 CD4記憶細胞和活化的樹突狀細胞與風(fēng)險基因和評分顯示出顯著相關(guān)性.?免疫檢查點是免疫治療的重要靶點。CTLA4、HAVCR2、ATIC 和 OLA1 的表達與風(fēng)險評分保持一致。HCC的免疫治療一直是人們關(guān)注的焦點。我們還分析了二硫化物風(fēng)險組與藥物治療之間的關(guān)系。抑制性免疫檢查點基因CTLA4、HAVCR2、ATIC、OLA1在高危組較高。低風(fēng)險組的 IPS 較高。低?；颊呙庖咴愿鼜??在 IMvigor210 免疫治療隊列中，CR/PR（完全緩解、部分緩解）組的風(fēng)險值高于 SD/PD（進展性疾病、穩(wěn)定疾?。?。在比較具有不同免疫治療結(jié)果的患者比例時，我們觀察到與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組中 CR/PR 患者的比例更高。具有高免疫原性的低風(fēng)險患者比例較低可能是由于某種免疫抑制。

此外，TIDE 評分還評估了對免疫檢查點抑制劑治療的臨床反應(yīng)。高 TIDE 評分表明對 ICB 的低反應(yīng)和不利的腫瘤結(jié)果。高危組TIDE評分、功能障礙評分較低。在高風(fēng)險組中獲得的較低綜合 TIDE 評分可能是由于免疫治療緩解的比例較高。

3.8?。腫瘤突變及藥敏分析

由于與高突變負(fù)荷相關(guān)的抗原性增加，高風(fēng)險 HCC 往往具有更長的生存時間。TCGA-LIHC高危組腫瘤突變率相對較高。雖然高突變組的預(yù)后比低突變組差但其免疫治療效果在以往經(jīng)驗中占優(yōu)勢[22]。隨后，我們分析了高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的突變譜。171例高?；颊叩耐蛔儽壤哌_88.89%，190例低?；颊叩耐蛔兟蕿?2.63%，TP53、CTNNB1、TTN ,MUC16和 PCLO 基因在兩個風(fēng)險組中都具有高突變頻率。

為了確定高風(fēng)險和低風(fēng)險患者的敏感藥物，我們分析了 197 種化療藥物的敏感性。敏感性結(jié)果顯示，Afuresertib、KRAS(G12C)、多拉匹莫德、米托蒽醌和奧沙利鉑在高危組中具有較高的敏感性。這些藥物可能會改善伴有二硫化物下垂的高危 HCC 患者的預(yù)后。西地尼布、達沙替尼、多西紫杉醇、紫杉醇和托沙替尼在高危組敏感性較低，而低危人群可能受益于這些藥物的治療。

3.9?。構(gòu)建列線圖以預(yù)測 HCC 的存活率

為了更好地預(yù)測 HCC 的預(yù)后，我們構(gòu)建了二硫鍵風(fēng)險評分的列線圖。本研究納入的HCC患者特征信息見表2。在本研究中，HCC隊列的患者生存數(shù)據(jù)排除了生存時間為0的患者信息。我們從三個HCC隊列中獲得了年齡、性別和分期三個臨床特征，排除了信息缺失的患者。根據(jù)構(gòu)建的列線圖，每個患者根據(jù)臨床信息對應(yīng)評分的總和，可以得到1、3、5年的百分比生存系數(shù)。得分為236的患者1年、3年和5年生存率分別為0.756、0.496和0.248。高風(fēng)險組的累積風(fēng)險更高。校準(zhǔn)曲線顯示諾模圖的預(yù)測結(jié)果接近實際概率。DCA 分析表明列線圖和風(fēng)險值具有更好的有效性。列線圖在 1、3 和 5 年時的 AUC 值分別為 0.762、0.743 和 0.702（。內(nèi)部訓(xùn)練集的 AUC 值均大于 0.75（1 年為 0.804，3 年為 0.760，5 年為 0.763。內(nèi)部測試集證實了列線圖 1、3 和 5 年總體生存的高精度。此外，在外部驗證集 GSE14520 中，諾模圖預(yù)測 1、3 和 5 年的 AUC 值均大于 0.6。校準(zhǔn)曲線顯示內(nèi)部訓(xùn)練集、測試集和外部驗證集都非常接近實際精度值。這些都表明二硫鍵相關(guān)列線圖在預(yù)測HCC患者的生存時間方面具有很高的價值。

SPP1和MYBL2可預(yù)測HCC的預(yù)后

我們還分析了四種基因預(yù)測 HCC 預(yù)后的能力。ROC曲線的AUC分別為APOC1(0.425)、SPP1(0.651)、IL7R(0.487)和MYBL2(0.636)可見SPP1和MYBL2在預(yù)測肝細胞癌預(yù)后方面較為突出?；诙蚧锬Ｐ椭械乃姆N生物標(biāo)志物，我們探索了它們在 HCC 中的能力。首先，我們收集了10對HCC及相應(yīng)的鄰近正常組織進行局部組織驗證，從組織中提取收集RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后用cDNA進行qPCR實驗。PCR結(jié)果顯示，HCC組織中APOC1、SPP1、MYBL2的mRNA含量高于癌旁組織。IL7R的mRNA水平在HCC組織中相對較低。APOC1、SPP1和MYBL2的蛋白免疫組化染色結(jié)果來自HPA。從圖8k可以看出，APOC1、SPP1和MYBL2在HCC組織中呈中度或高度染色，在正常肝組織中呈弱染色。這與 mRNA 的水平一致。