標(biāo)題：Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas

期刊：NAT?BIOTECHNOL（IF= 68.164）

技術(shù)：ScRNA_Seq、空間轉(zhuǎn)錄組測序（ST）

導(dǎo)語

單細胞RNA測序(scRNA-seq)能夠系統(tǒng)地識別組織中的細胞群，但表征它們的空間組織仍然具有挑戰(zhàn)性。本研究結(jié)合了基于微陣列的空間轉(zhuǎn)錄組（ST）方法，利用一系列spots揭示基因表達的空間模式。開發(fā)了Multimodal intersection analysis (MIA)多模式交叉分析，對原發(fā)性胰腺腫瘤應(yīng)用發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和癌細胞的亞群具有空間限制。此外，還識別出表達應(yīng)激反應(yīng)基因模塊的炎癥性成纖維細胞和癌細胞的共定位。

研究結(jié)果

1. 用 scRNA-seq 識別 PDAC 中的細胞群

本研究選用了兩例未經(jīng)治療的PDAC患者（PDAC-A和PDAC-B）的新鮮原發(fā)腫瘤，用于平行scRNA-seq和ST分析。基于單細胞測序結(jié)果，分別繪制了兩例患者的單細胞表達譜，PDAC-A和PDAC-B腫瘤中分別有的15種和11種不同的種群，共享的細胞類型的基因表達特征顯示患者樣本之間具有很強的相關(guān)性，驗證了對細胞類型的注釋?；趕cRNA-seq的拷貝數(shù)變異（CNV）分析區(qū)分PDAC癌細胞和非惡性導(dǎo)管細胞，發(fā)現(xiàn) PDAC-A 中的兩個cluster和 PDAC-B 中的一個cluster顯示異常 CNV。PDAC-A樣本cluster-1和cluster-2表現(xiàn)出TM4SF1（cluster-1）或S100A4（cluster-2）的高表達，而PDAC-B樣本中拷貝數(shù)異常的cluster在TM4SF1表達中高，表明PDAC-A cluster-1和PDAC-B癌癥群的相似性。為了進一步驗證 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中識別的TM4SF1和S100A4表達種群是否代表癌細胞群，在源自同一患者的組織石蠟切片上對 TM4SF1 和 S100A4 進行了雙重免疫熒光染色進一步驗證了這一現(xiàn)象。

2. PDAC的空轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄組測序

組織切片及H&E染色揭示了PDAC的四個主要區(qū)域：癌細胞粘連區(qū)、非惡性導(dǎo)管上皮區(qū)、基質(zhì)區(qū)域和胰腺腺泡區(qū)，其中PDAC-B的患者組織不包含正常的胰腺腺泡區(qū)。然后對樣本進行空間轉(zhuǎn)錄組測序，使用芯片特定位置的barcode對序列進行解碼，識別每個轉(zhuǎn)錄本在組織內(nèi)的空間定位。使用 H&E 染色圖像估計每個 ST spot捕獲了大約 20-70 個細胞、約2400個UMI和大約1000個唯一基因，其中，不同區(qū)域細胞數(shù)量差異可能較大。例如，結(jié)締組織密集的高纖維化區(qū)域(因此細胞含量較低)每個點的細胞數(shù)量可能比細胞密度高的區(qū)域(如胰腺的腺泡)低。對所有ST spot中表達變異程度最高的基因進行主成分分析（PCA）后根據(jù)主成分對每個ST陣列的spot進行聚類，發(fā)現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)某些基因表達注釋與病理學(xué)區(qū)域注釋相匹配。接下來為了集成 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)集，作者開發(fā)了 多模式交叉分析Multimodal intersection analysis (MIA)。首先劃定細胞類型特定和組織區(qū)域特定基因集，然后確定它們的重疊程度，相比于隨機數(shù)值判斷其重疊程度是否顯著富集。在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中識別每個細胞類型來定義基因集，相比于其他細胞類型這些基因的表達該細胞類型中具有較高的統(tǒng)計學(xué)水平，隨后識別出每個空間區(qū)域的表達率明顯高于其他區(qū)域的基因。通過超幾何檢驗，評估在 scRNA-seq 和 ST 模式中提取的基因集是否顯著重疊，進而將空間信息與轉(zhuǎn)錄組信息聯(lián)合起來進行其他分析。

3?.跨組織區(qū)域細胞類型亞群的鑒定和定位

scRNA-seq 最有用的方面之一是它能夠揭示細胞類型中不同的亞群。因此，作者試圖通過識別細胞類型中的亞群，然后應(yīng)用 MIA 來查詢整個組織空間的映射來描述細胞群體內(nèi)部的異質(zhì)性。基于scRNA-seq發(fā)現(xiàn)兩個腫瘤樣本中大多數(shù)細胞由KRT19+導(dǎo)管細胞組成，這是胰腺外分泌系統(tǒng)的兩種主要成分細胞類型之一。作者總共確定了四個導(dǎo)管細胞亞群：（1）表達APOL1和缺氧相關(guān)基因的導(dǎo)管細胞亞群；（2）表達TFF1、TFF2和TFF3的終端導(dǎo)管亞群；（3）表達CRISP3和CFTR的中心亞群；（4）表達MHC-II類分子和補體通路成分的抗原呈遞導(dǎo)管細胞。雖然MHC-II類分子主要表現(xiàn)在抗原呈遞細胞（B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞）的表面，但肝臟、胃腸道和呼吸道的上皮細胞表達MHC-II類分子。由于它們存在于腫瘤中，這些抗原呈遞導(dǎo)管細胞很可能通過促進T細胞活化，在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮作用。這四種亞群中，第1類和第4類是先前的單細胞測序沒有報道過的，作者通雙重免疫熒光實驗驗證了亞群的存在。

與細胞類型分析一樣，作者使用每個導(dǎo)管亞群特有的標(biāo)記基因，使用 MIA 確定這些導(dǎo)管亞群在組織切片中的富集情況。作者發(fā)現(xiàn)PDAC-A患者中的所有導(dǎo)管亞群都富集在組織的導(dǎo)管區(qū)域。相比之下，只有缺氧和晚期導(dǎo)管細胞群在癌癥區(qū)域顯著豐富。這些導(dǎo)管細胞所展示的轉(zhuǎn)錄表型可能反映來自周圍組織的環(huán)境信號，例如由于含氧量低，癌區(qū)導(dǎo)管細胞可能表達缺氧反應(yīng)相關(guān)基因。相比之下，PDAC-B 中的導(dǎo)管亞群都完全富集于導(dǎo)管上皮區(qū)域。

4. 整合分析不同癌癥人群PDAC組織

在PDAC-A scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了兩個癌細胞群，這些數(shù)據(jù)在基因和轉(zhuǎn)錄上似乎都截然不同。雖然作者發(fā)現(xiàn)這兩種癌癥種群在相應(yīng)的ST癌癥區(qū)域中都富含，但它們是否與該區(qū)域內(nèi)不同的細胞類型同位？為了探索PDAC-A患者兩個癌癥種群是否在相同切片區(qū)域共定位的問題，作者對該患者進行了額外的組織切片，確保 scRNA-seq 數(shù)據(jù)代表所有 ST 部分：腫瘤切片先分為三個部分，然后每個部分被分在 ST 和 scRNA-seq 之間。通過比較PDAC-A新增的區(qū)域，作者確定了各自PDAC-A樣本區(qū)域特有的基因列表之間的重疊，發(fā)現(xiàn)整個ST數(shù)據(jù)集的癌癥和基質(zhì)區(qū)域之間有顯著重疊。對于每個組織部分中癌癥豐富的區(qū)域，使用分層聚類進一步將癌癥豐富的區(qū)域劃分為轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的分區(qū)。在定義了每個子區(qū)域特有的基因集后，再次應(yīng)用 MIA 映射方法來研究與子區(qū)域相關(guān)的基因集、每個細胞類型定義的基因集和 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的子群之間的重疊，進一步定義了細胞類型/亞群與組織空間之間的關(guān)聯(lián)性。

5. 利用MIA繪制癌細胞狀態(tài)和基質(zhì)亞型之間的關(guān)系

解析腫瘤微環(huán)境下的細胞狀態(tài)關(guān)系最近對癌細胞scRNA-seq數(shù)據(jù)的研究表明，在膠質(zhì)母細胞瘤、黑色素瘤、頭頸癌等多種癌癥類型中，細胞狀態(tài)是獨一無二的。由于ST提供空間信息，是否可以繪制癌細胞狀態(tài)到不同的空間組織區(qū)域，并描述它們與其他細胞類型的相互作用。為此，作者生成了第三個PDAC scRNA-seq數(shù)據(jù)集并定義PDAC癌細胞中的三個基因表達模塊。根據(jù)每個模塊的基因，注釋這些作為缺氧反應(yīng)，氧化磷酸化和應(yīng)激響應(yīng)模塊。作者發(fā)現(xiàn)單核細胞和T/NK細胞在應(yīng)激反應(yīng)模塊區(qū)域大量富集。綜合分析TCGA PDAC數(shù)據(jù)，結(jié)果表明涉及炎癥性成纖維細胞和表達應(yīng)激基因模塊的癌細胞之間的關(guān)系，并驗證了MIA方法對于生成細胞群與空間受限結(jié)構(gòu)的關(guān)系的效能。

參考文章：

Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas[J]. Nature biotechnology, 2020, 38(3): 333-342.