目前，肥胖癥已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)世界肥胖聯(lián)盟發(fā)布的2023版《世界肥胖地圖》，到2035年，全球超重或肥胖人口將超過40億，占全球人口的51%。肥胖受環(huán)境因素影響，但也與遺傳因素密切相關(guān)。

目前最大規(guī)模的肥胖癥GWAS（Genome wide association study, 全基因組關(guān)聯(lián)分析）研究發(fā)現(xiàn)了約1000個與BMI相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP），解釋了約6.0%的BMI變化。值得注意的是，多個與肥胖相關(guān)的常見變異都位于FTO基因的內(nèi)含子區(qū)域，并在大多數(shù)種族人群中顯示出肥胖的風(fēng)險效應(yīng)。其中，rs1421085 T>C變異與肥胖存在密切關(guān)聯(lián)，并被推測為功能變異之一，但在生物體水平上仍缺乏證據(jù)。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院王計(jì)秋教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)近日利用全身性和棕色脂肪細(xì)胞特異性變異敲入方法在小鼠身上重現(xiàn)了同源的人類變異。他們發(fā)現(xiàn)，rs1421085 T>C是一種促進(jìn)棕色脂肪產(chǎn)熱的功能變異。這篇題為“The rs1421085 variant within FTO promotes brown fat thermogenesis”的論文于7月17日發(fā)表在《Nature Metabolism》雜志上。

研究材料與方法

在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了由賽業(yè)生物構(gòu)建的兩種全身性（KICas9和KIES）和一種棕色脂肪細(xì)胞特異性rs1421085 T>C KI小鼠模型。他們測定了各種小鼠的脂肪含量和能量消耗，并通過注射CL316,243或急性寒冷暴露來測定棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。他們還通過RT-PCR和western blot分析來測定Ucp1等多個產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)。在分析rs1421085 T>C的作用機(jī)制時，他們采用了染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（3C-qPCR）分析。

技術(shù)路線

01

構(gòu)建KICas9和KIES小鼠模型，測定rs1421085 T>C變異的肥胖保護(hù)作用

02

測定同源rs1421085 T>C變異是否促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱

03

通過棕色脂肪細(xì)胞特異性的KI小鼠模型確認(rèn)rs1421085 T>C的作用

確定rs1421085 T>C變異促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱的機(jī)制

研究結(jié)果

1

rs1421085 T>C變異增強(qiáng)了棕色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱

分析顯示，人類rs1421085變異的T等位基因與小鼠同源位點(diǎn)具有高度的相似性。為了明確人類rs1421085 T>C變異的生物學(xué)功能，研究人員利用了賽業(yè)生物提供的由CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的攜帶同源單核苷酸突變的全身性基因敲入（KI）小鼠模型（KICas9，圖1b）。在喂食高脂飲食后，雄性KICas9小鼠的體重增加和脂肪含量少于野生型對照小鼠，特別是腹股溝白色脂肪組織（iWAT）。

為了進(jìn)一步證實(shí)該變異的肥胖保護(hù)作用，他們又采用基因靶向策略，以小鼠胚胎干細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建了第二種全身性同源rs1421085_C KI小鼠模型（KIES，圖1e，賽業(yè)生物提供）。與對照相比，KIES小鼠在高脂飲食條件下體重增加較少，脂肪量較少，且肝臟脂肪積累較少，與KICas9小鼠的表型高度相似。與野生型小鼠相比，KIES小鼠的總能量消耗明顯增加。這些結(jié)果表明，rs1421085 T>C變異KI小鼠增加了總的能量消耗，并抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。

研究人員注意到，KICas9小鼠棕色脂肪組織（BAT）中的脂肪細(xì)胞更小更密。同時，KICas9小鼠BAT中產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)也顯著增加，包括Ucp1、Pgc-1α、Prdm16等。他們隨后從BAT中分離出基質(zhì)血管成分（SVF），并在體外誘導(dǎo)為成熟的棕色脂肪細(xì)胞。與對照相比，KICas9和KIES小鼠模型的棕色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)增加以及耗氧率增加。這些體內(nèi)和體外的結(jié)果表明，同源rs1421085 T>C變異增強(qiáng)了棕色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱。

2

rs1421085 T>C變異抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖

為了驗(yàn)證BAT中的同源rs1421085 T>C變異是否對肥胖抵抗表型有重要貢獻(xiàn)，研究人員將同源rs1421085floxp/floxp（KIfl/fl）小鼠與Ucp1-Cre小鼠雜交，構(gòu)建了棕色脂肪細(xì)胞特異性的rs1421085 T>C KI小鼠模型（圖2，賽業(yè)生物提供）。與兩個全身性KI模型相似，Ucp1-KIfl/fl小鼠對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖也表現(xiàn)出抵抗力。值得注意的是，Ucp1-KIfl/fl小鼠的總能量消耗與對照相比顯著增加，且脂滴變小，線粒體增加，Ucp1等產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)也增加。綜合這三種KI模型的表型，研究人員認(rèn)為同源rs1421085 T>C變異增強(qiáng)了棕色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱，并抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。

3

rs1421085 T>C變異上調(diào)了FTO的表達(dá)

那么，rs1421085 T>C變異會對哪些基因的表達(dá)產(chǎn)生影響？rs1421085位點(diǎn)附近的幾個基因（包括IRX3/IRX5/IRX6基因簇、RPGRIP1L和FTO）被認(rèn)為是FTO變異的下游候選目標(biāo)。于是，研究人員評估了這些基因在三種KI小鼠模型的BAT中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Fto在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)都顯著提高。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，包含rs1421085的“次要等位基因”的1-kb基因組區(qū)域顯示出比主要等位基因更高的增強(qiáng)子活性。因此，他們構(gòu)建了攜帶1-kb人類基因組片段的報告質(zhì)粒，正向或反向插入人類FTO啟動子序列的前方。當(dāng)反向連接時，攜帶T（主要）或C（次要）等位基因的片段都增強(qiáng)了FTO啟動子的活性，且攜帶C等位基因的片段表現(xiàn)出更高的活性（圖3）。通過染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（3C-qPCR）分析，他們發(fā)現(xiàn)KIES小鼠（C-等位基因攜帶者）棕色脂肪細(xì)胞與Fto啟動子的相互作用頻率高于野生型小鼠（T-等位基因攜帶者）。這一結(jié)果表明，rs1421085 T>C變異導(dǎo)致增強(qiáng)子區(qū)域與Fto啟動子之間形成更強(qiáng)的染色質(zhì)環(huán)。

為了證實(shí)FTO在棕色脂肪細(xì)胞中的功能，研究人員利用shRNA抑制了原代小鼠棕色脂肪細(xì)胞中Fto的表達(dá)。Fto的敲減顯著降低了Ucp1等產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)，而FTO的過表達(dá)則提高了產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)。由此可見，F(xiàn)TO促進(jìn)了棕色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱。此外，當(dāng)Fto被沉默或抑制時，KIES棕色脂肪細(xì)胞中檢測到的Ucp1表達(dá)增加和耗氧率增加都在很大程度上被抑制。這些結(jié)果顯示，同源rs1421085 T>C變異主要通過上調(diào)FTO表達(dá)來增強(qiáng)棕色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱和Ucp1表達(dá)。

4

熱中性削弱了rs1421085 T>C變異的產(chǎn)熱效應(yīng)

最后，研究人員評估了小鼠中rs1421085 T>C變異對肥胖的影響是否與BAT激活程度有關(guān)，因?yàn)樾∈笠恢倍紦碛袩峒せ畹腂AT，而人類的BAT激活在出生時就達(dá)到頂峰。他們給KIES小鼠和野生型小鼠投喂高脂飲食，并將其置于不同溫度下。值得注意的是，22°C時觀察到的組間體重差異在30°C（熱中性）時基本消失，而30°C時KIES小鼠的脂肪量和脂肪組織量與野生型小鼠相當(dāng)，表明當(dāng)BAT失活時，熱中性可以減弱rs1421085 T>C變異對能量消耗和肥胖的影響。不過，同樣在30°C下，KIES小鼠注射CL316,243后的總能量消耗增加，背表面溫度升高，表明rs1421085 T>C變異促進(jìn)了BAT產(chǎn)熱。

研究結(jié)論

這項(xiàng)研究采用三種rs1421085 T>C KI小鼠模型來探索FTO rs1421085 T>C變異的功能。在收集這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型的體內(nèi)和體外證據(jù)后，研究人員發(fā)現(xiàn)rs1421085 T>C變異通過Fto–Ucp1軸來調(diào)控BAT產(chǎn)熱和肥胖。這一證據(jù)支持了rs1421085 T>C變異通過增強(qiáng)具有功能性BAT的哺乳動物的產(chǎn)熱來對抗寒冷。

原文檢索：

[1]Zhang, Z., Chen, N., Yin, N. et al. The rs1421085 variant within FTO promotes brown fat thermogenesis. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00847-2