摘要

PANoptosis 是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡途徑，涉及細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和壞死過(guò)程之間的串?dāng)_和協(xié)調(diào)。然而，PANoptosis 相關(guān)基因 (PRG) 在結(jié)腸癌預(yù)后和免疫景觀中的作用仍然廣為人知。在這里，我們對(duì)從以前的研究中確定的 19 個(gè) PRG 的表達(dá)數(shù)據(jù)和從 TCGA 和 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的結(jié)腸癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)腸癌病例被分為兩個(gè) PRG 簇，并鑒定了預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)基因 (PRDEG)。然后將患者數(shù)據(jù)分成兩個(gè)相應(yīng)的不同基因簇，并分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、患者預(yù)后和免疫景觀之間的關(guān)系。鑒定出的 PRG 和基因簇與患者的生存和免疫系統(tǒng)以及癌癥相關(guān)的生物過(guò)程和途徑相關(guān)。確定了基于七個(gè)基因的預(yù)后特征，并根據(jù)計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。還根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他臨床特征開(kāi)發(fā)了用于預(yù)測(cè)患者生存的列線圖模型。因此，高風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后較差，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫細(xì)胞豐度、癌癥干細(xì)胞（CSC）指數(shù)、檢查點(diǎn)表達(dá)以及對(duì)免疫療法和化療藥物的反應(yīng)有關(guān)。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) (qRT-PCR) 的結(jié)果顯示 LGR5 和 VSIG4 在正常和結(jié)腸癌樣本之間差異表達(dá)。綜上所述，我們展示了基于 PANoptosis 的分子聚類(lèi)和預(yù)后特征預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者生存和腫瘤微環(huán)境 (TME) 的潛力。我們的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提高我們對(duì) PANoptosis 在結(jié)腸癌中的作用的理解，并有助于開(kāi)發(fā)更有效的治療策略。

結(jié)果

結(jié)腸癌 PANoptosis 相關(guān)基因的遺傳變異概況

從 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載 457 名 COAD 患者的表達(dá)數(shù)據(jù)，比較 41 名正常和 473 名腫瘤樣本的 PRG 表達(dá)水平。本研究包括來(lái)自先前研究的 19 個(gè) PRG。結(jié)腸癌患者 19 個(gè) PRG 的體細(xì)胞突變發(fā)生率顯示在圖 1A;?399 個(gè)樣本中有 81 個(gè) (20.3%) 的 PRG 發(fā)生了改變。在 19 個(gè) PRG 中，NLRP3顯示出最高的突變頻率。圖 1B顯示 PRG 中 CNV 改變?cè)谄淙旧w上的位置。與其在正常樣本中的表達(dá)相比，12 個(gè) PRG 在結(jié)腸癌樣本中有差異表達(dá)。分析了 19 個(gè) PRG 的體細(xì)胞拷貝數(shù)變化；ZBP1、GSDMD、AIM2和NLRP3具有最高的拷貝數(shù)變異 (CNV)，而CASP7、CASP1、CASP6和IRF3顯示出顯著的 CNV 降低（圖 1C).?在這 12 個(gè) PRG 中，7 個(gè)基因在腫瘤樣本中上調(diào)，包括CASP8、FADD、TAB3、PSTPIP2、PARP1、MLKL和TRADD，而其他 5 個(gè)基因，包括NLRP3、TAB2、CASP7、RIPK1和RIPK3，在腫瘤樣本中下調(diào)。腫瘤樣本 (?p?< 0.05) (圖 1D).

結(jié)腸癌中 PANoptosis 相關(guān)基因簇的鑒定

為了探索 19 個(gè) PRG 之間的相互作用及其預(yù)后意義，構(gòu)建了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，如圖所示圖 2A.?補(bǔ)充圖 S1顯示了 PRG 表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后之間關(guān)系的 Kaplan-Meier 曲線。進(jìn)行共識(shí)聚類(lèi)分析以探索 PRG 表達(dá)與腫瘤分類(lèi)之間的關(guān)系（補(bǔ)充圖 S2）。確定了具有最高組內(nèi)相關(guān)性和最低組間相關(guān)性的集群。通過(guò)增加聚類(lèi)變量（k），我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)k?=2時(shí)，分類(lèi)符合標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù) PRG 表達(dá)水平，結(jié)腸癌患者被分為兩個(gè) PRG 簇（A 和 B）（圖 2B).?如圖所示圖 2C, PRG 集群 A 中的患者的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于集群 B 中的患者 (?p?= 0.048)。PCA 顯示 PRG 簇 A 和 B 之間的分離令人滿意（圖 2D).?圖 2E圖顯示了結(jié)腸癌患者中 PRG 簇與臨床特征和 PRG 表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。腫瘤浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與 PRG 簇相關(guān) (?p?< 0.05)。GSVA 顯示 PRG 簇 A 在免疫相關(guān)通路中顯著富集，包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抗原加工和呈遞、原發(fā)性免疫缺陷、B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞受體信號(hào)通路（圖 2F).?為了評(píng)估兩個(gè)簇之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異，進(jìn)行了 ssGSEA，結(jié)果顯示 PRG 簇 A 具有更高的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平，包括活化的 B 細(xì)胞、活化的 CD4 + T 細(xì)胞、活化的 CD8 + T 細(xì)胞-細(xì)胞、活化的樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（圖 2G).

基于差異表達(dá)基因的基因簇鑒定

鑒定了 DEG，GO 和 KEGG 分析顯示了相關(guān)的生物過(guò)程 (BP)、細(xì)胞成分 (CC)、分子功能 (MF) 和通路 (圖 3A、B).?這些DEGs主要與T細(xì)胞活化的BP、白細(xì)胞細(xì)胞粘附、干擾素-γ反應(yīng)相關(guān)，并與質(zhì)膜外側(cè)、主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II類(lèi)等CC相關(guān)蛋白復(fù)合物和MHC蛋白復(fù)合物。此外，它們還參與了免疫受體活性、趨化因子活性和抗原結(jié)合的 MF。根據(jù)KEGG分析，這些DEG參與了某些癌癥相關(guān)通路，包括趨化因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路。使用單變量 Cox 回歸分析確定 PRDEG。然后根據(jù) PRDEG 表達(dá)將患者分為兩個(gè)簇（基因簇 A 和基因簇 B）（補(bǔ)充圖 S3；圖 3C) 顯示集群 A 的存活率高于集群 B (?p?= 0.002)。在圖 3D，箱線圖顯示FADD、CASP6、CASP7、IRF1、AIM2、ZBP1、CASP1、RIPK1、RIPK3和TRADD在簇 A 中上調(diào)，而TAB3和PARP1在簇 B 中下調(diào) (?p?< 0.05)。熱圖顯示了基因簇與臨床特征之間以及 PRDEG 表達(dá)與 PRG 簇之間的關(guān)聯(lián)。此外，基因簇與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（p?< 0.05）（圖 3E).

與 PANoptosis 相關(guān)的預(yù)后特征的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證

進(jìn)行 LASSO 和 Cox 回歸分析以篩選與預(yù)后相關(guān)的 DEPRG（圖 4A、B).?選擇后，根據(jù)以下公式將七個(gè)基因納入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算中：箱線圖顯示 PRG 簇 B 和基因簇 B 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高于 PRG 簇 A 和基因簇 A（圖 4C、D).?Sankey 圖顯示了 PRG 簇、基因簇、風(fēng)險(xiǎn)組和生存狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)（圖 4E).?十九個(gè) PRG 中的十五個(gè)在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間差異表達(dá)（圖 4F).?七個(gè)基因被用來(lái)構(gòu)建預(yù)后特征；圖 5A顯示了這七個(gè)基因在兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之間的表達(dá)差異。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將患者分為高危組和低危組，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)較高（圖 5B).?如圖所示圖 5C，繪制了 KM 曲線以顯示兩組之間的生存差異。高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存概率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者 (?p?< 0.001)。繪制ROC曲線檢驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)測(cè)效率，1年、3年、5年生存率的AUC分別為0.612、0.650、0.676（圖 5D).?還顯示了 TCGA（補(bǔ)充圖 S4）和GSE39582（補(bǔ)充圖 S5）隊(duì)列中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分結(jié)果。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他臨床特征用于構(gòu)建列線圖模型（圖 5E).?顯示結(jié)腸癌患者諾模圖預(yù)測(cè)生存概率與實(shí)際生存概率之間差異的校準(zhǔn)圖表明，預(yù)測(cè)生存概率接近實(shí)際生存概率（圖 5F), 表明這個(gè)列線圖模型準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)了結(jié)腸癌患者的生存。三個(gè)獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列的結(jié)果，即GSE17536?(圖 5G,?p?= 0.041, 1 年 AUC = 0.598, 3 年 AUC = 0.624, 5 年 AUC = 0.589),?GSE17537?(圖 5H,?p?= 0.048, 1 年 AUC = 0.728, 3 年 AUC = 0.624, 5 年 AUC = 0.542),?GSE29621?(圖 5I,?p?= 0.011, 1 年 AUC = 0.763, 3 年 AUC = 0.717, 5 年 AUC = 0.702), 表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以有效預(yù)測(cè)患者的生存。

高危和低危人群腫瘤微環(huán)境的比較評(píng)價(jià)

圖 6A顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫細(xì)胞豐度之間的相關(guān)性：M0 巨噬細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)，而幼稚 B 細(xì)胞、活化樹(shù)突細(xì)胞、靜息樹(shù)突細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞細(xì)胞、靜息 NK 細(xì)胞、漿細(xì)胞、活化記憶 CD4 + T 細(xì)胞、靜息記憶 CD4 + T 細(xì)胞、CD8 + T 細(xì)胞和濾泡輔助性 T 細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。還評(píng)估了免疫細(xì)胞的豐度與預(yù)后特征中的七個(gè)基因之間的關(guān)系（圖 6B).?計(jì)算兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組的TME評(píng)分，發(fā)現(xiàn)高危組的基質(zhì)評(píng)分較高，免疫評(píng)分較低（圖 6C).

高危與低危人群突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及腫瘤干細(xì)胞指數(shù)比較分析

分析兩組結(jié)腸癌患者體細(xì)胞突變的差異；高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中突變最多的五個(gè)基因是APC、TP53、TTN、KRAS和SYNE1（圖 7A、B).?TMB (圖 7C) 和微星 (圖 7D) 與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分沒(méi)有顯著關(guān)系，而 CSC (圖 7E) 與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān) (?R?= ?0.15,?p?< 0.01)。

對(duì)免疫療法和化療藥物的反應(yīng)

為了分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)潛在檢查點(diǎn)阻斷療法的能力，繪制了箱線圖以顯示高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)的差異（圖 8A).?檢查點(diǎn)基因，包括CTLA4、LAG3、ID O 2、CD274和PDCD1，在低風(fēng)險(xiǎn)人群中具有更高的表達(dá)水平。在圖 8B、cluster1 (C1)、C2、C3 和 C4 分別代表傷口愈合、IFN-γ 顯性、炎癥和淋巴細(xì)胞耗盡免疫亞群 (?Thorsson 等人，2019 年)。結(jié)果顯示，C3樣本在兩組間分布幾乎均等，但高風(fēng)險(xiǎn)亞組的C1和C4樣本多于低風(fēng)險(xiǎn)亞組，C2樣本較少。小提琴圖顯示了 IPS 與風(fēng)險(xiǎn)組之間的關(guān)系；較高的 IPS 代表對(duì)PD-1和CTLA-4阻斷劑的更好反應(yīng)（圖 8C).?我們還發(fā)現(xiàn)，八種藥物在高危人群中具有較低的 IC50 值，包括貝沙羅汀、比卡魯胺、達(dá)沙替尼、多西他賽、艾司洛爾、伊馬替尼、米哚妥林和帕唑帕尼（圖 8D).

通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證 LGR5、VSIG4、GZMB 和 ITLN1 的表達(dá)水平

在預(yù)后特征的七個(gè)基因中，?LGR5、VSIG4、GZMB和ITLN1在來(lái)自 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)腸癌樣本中顯著差異表達(dá)（補(bǔ)充圖 S6）。通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)腸癌和癌旁正常組織中LGR5、VSIG4、GZMB和ITLN1的表達(dá)水平。LGR5在腫瘤組織中的表達(dá)明顯增高（圖 9A) 而VSIG4在正常組織中的表達(dá)水平更高 (?p?< 0.05) (圖 9B).?GZMB的表達(dá)水平無(wú)顯著差異（圖 9C) 和 ITLN1 (圖 9D) 在正常和腫瘤樣本之間。