代謝組是對生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物全譜分析的一種研究手段，代謝產(chǎn)物包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類生物大分子以及其他小分子物質(zhì)，目前主要是檢測1000Da以下的物質(zhì)。代謝組研究具有高通量的檢測能力、高靈敏度和準(zhǔn)確度、非侵入性、非破壞性、全面性、數(shù)據(jù)資源整合等特點(diǎn)。通過LC-MS/GC-MS評估生物體或細(xì)胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的水平以及變化，可以進(jìn)一步研究這些代謝產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異基因或微生物的關(guān)系。在這個系統(tǒng)生物學(xué)和功能基因組時代，將多個組學(xué)聯(lián)合運(yùn)用、從整體上解釋生物學(xué)問題才是大勢所趨。所以代謝組學(xué)一般會和基因組、轉(zhuǎn)錄組等聯(lián)合分析，深入解釋功能基因、表達(dá)調(diào)控等問題。

? ? ? 言歸正傳，一起來看看常見的問題與解答吧!

問題1. 非靶、靶向、類靶向代謝組傻傻分不清楚？?

非靶代謝：類似于轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組，篩選不同組之間的差異代謝物，掃描模式是全掃描（full scan），屬于盲篩，得到物質(zhì)的相對定量結(jié)果。后續(xù)要進(jìn)行一系列生信分析。

凌恩生物非靶向代謝項目，采用mzCloud搭配mzVault數(shù)據(jù)庫和Masslist數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜庫注釋。數(shù)據(jù)庫具體信息如下：

mzCloud數(shù)據(jù)庫：該數(shù)據(jù)庫是Thermo公司基于標(biāo)品在Orbitrap質(zhì)譜儀上構(gòu)建的包含一級及兒既高分辨率精確質(zhì)量（HRAM）譜圖數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，是在線實(shí)時更新數(shù)據(jù)庫?；诂F(xiàn)有版本（截至2020年4月7日），mzCloud 在線數(shù)據(jù)庫有17802 種化合物，6,536,790張二級圖譜。分為16大類物質(zhì)，其中內(nèi)源性代謝物有3000+種。內(nèi)源性代謝物又可細(xì)分為氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、糖代謝途徑中的各種代謝物、生物堿、黃酮類、萜類、酚胺類、激素及其衍生物、脂肪酸等。

mzVault數(shù)據(jù)庫：該數(shù)據(jù)庫是含二級譜圖的本地數(shù)據(jù)庫，包含Thermo公司提供的譜圖和公司從其他公共數(shù)據(jù)庫中搜集到的與Orbitrap質(zhì)譜儀匹配的譜圖，其中包括普通代謝物質(zhì)近 2000 種，脂質(zhì)類物種近10萬種。

mzCloud和mzVault 都是含有二級譜圖的數(shù)據(jù)庫，通過子離子、母離子同時匹配， 代謝物鑒定準(zhǔn)確性最高。

Masslist數(shù)據(jù)庫：該數(shù)據(jù)庫是公司積累的包含內(nèi)源性物質(zhì)信息的一級譜圖本地數(shù)據(jù)庫， 基于一級庫鑒定到的物質(zhì)可以作為參考。

靶向代謝：客戶已經(jīng)明確要檢測的物質(zhì)，首先用這些物種的標(biāo)準(zhǔn)品，配置不同濃度的溶液，上機(jī)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立檢測該類物質(zhì)的方法，驗證方法的專屬性、基質(zhì)效應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等方面，屬于絕對定量。
凌恩生物部分靶向代謝檢測物質(zhì)，如下：

類靶向代謝：核心在于類靶向代謝數(shù)據(jù)庫，根據(jù)客戶不同的樣本類型分為植物類靶向數(shù)據(jù)庫和人&動物類靶向數(shù)據(jù)庫兩種，植物庫中包含 3250+的代謝物，人&動物數(shù)據(jù)庫中包含 2200+的代謝物；按照 sMRM（Schedule Multiple Reaction Monitoring）的采集模式對樣本中所含代謝物進(jìn)行采集，可檢測的物質(zhì)是我們數(shù)據(jù)庫中包含的代謝物，所以老師有關(guān)注的物質(zhì)的時候需要做好售前咨詢工作，避免出現(xiàn)關(guān)注的物質(zhì)不在數(shù)據(jù)庫中而導(dǎo)致檢測不到的情況，也是相對定量。后續(xù)要進(jìn)行一系列生信分析。
植物-類靶向數(shù)據(jù)庫V2.0：

人&動物-類靶向數(shù)據(jù)庫V2.0：

問題2.非靶向代謝和類靶向代謝是否能給出代謝物的有無的結(jié)果？?

不能提供真正意義上的代謝物的有無。

類靶向和非靶代謝都要進(jìn)行缺失值填充，即使是缺失值填充前的數(shù)據(jù)，鑒定到的這些物質(zhì)也是基于儀器篩選出來的有無，而不是真正的有無，沒有鑒定到的原因可能是樣本中沒有這個物質(zhì)，也可能是含量很低而被軟件過濾掉了。

問題3.正負(fù)離子模式是指什么？??

代謝物的性質(zhì)不同，離子化后，有的容易帶正電荷，有的容易帶負(fù)電荷。為了能檢測到更多的代謝物，所以一般分為正負(fù)離子兩個模式分別去檢測。有些物質(zhì)屬于兩性物質(zhì)，在正負(fù)模式下都會被檢測出。

問題4.代謝組生物學(xué)重復(fù)數(shù)如何設(shè)置？?

植物類靶向代謝生物學(xué)重復(fù)數(shù)≥6，根據(jù)目前做過的類靶向項目來看，生物學(xué)數(shù)目小于 6 的項目，鑒定結(jié)果和組內(nèi)的相關(guān)性不是很好，這會影響 P 值的計算進(jìn)而影響差異代謝物的篩選，而且有離群點(diǎn)也不能剔除，所以推薦生物學(xué)重復(fù)數(shù)要大于 6，建議 6個及以上。

問題5.非靶向代謝組中，關(guān)注某個物質(zhì)，但檢測結(jié)果中卻沒有，是什么原因，如何改進(jìn)？
1、非靶向代謝物提取方法需要盡可能多的提取到大多數(shù)代謝，對于特定代謝物來說，該方法并非最優(yōu)的提取方法；

2、非靶向代謝掃描模式是 DDA（數(shù)據(jù)依賴性），在特定物質(zhì)出峰處有其它物質(zhì)干擾，因此未采集到該物質(zhì)的譜圖信息；

3、搜庫過程，由于低于設(shè)置的閾值（質(zhì)量偏差：5ppm、信號強(qiáng)度：100000、信噪比而被過濾掉。

因為目前任何一種技術(shù)平臺都無法檢測到全部的代謝物質(zhì)，非靶向代謝靈敏度相對較低，

綜上，如有明確的目標(biāo)代謝物，建議直接選擇靶向代謝產(chǎn)品并優(yōu)化提取方法。

問題6.代謝物提取通常采用什么方法？?

色譜相分離通常取決于含有甲醇、水和氯仿的萃取溶液，具有高溶解度的代謝物，例如碳水化合物通常在甲醇、水中提??；而具有低溶解度的代謝物，例如膜脂和脂肪酸通常在氯仿、水中提取。

問題7.如果想檢測的物質(zhì)不在靶向檢測列表中怎么辦？

由于代謝物有數(shù)萬種，并非所有物質(zhì)都被檢測過。另外，現(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫或商業(yè)數(shù)據(jù)庫中也不一定包含該物質(zhì)的一級或者二級質(zhì)譜圖。因此，可以按照定制化產(chǎn)品進(jìn)行評估，提供待檢測的物質(zhì)，并查找相應(yīng)檢測方法的文獻(xiàn)，以此評估定制靶向產(chǎn)品的可行性。

但靶向產(chǎn)品的開發(fā)需要購買標(biāo)準(zhǔn)品，建立檢測物質(zhì)的方法學(xué)，再進(jìn)行樣本的檢測，因此周期較長，成本也較高。

問題8.代謝物種類繁多，為何只能鑒定到幾百到上千個物質(zhì)？

由于代謝物分子量小，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，只通過分子量和電荷數(shù)（一級質(zhì)譜）鑒定不是很準(zhǔn)確，因此更依賴標(biāo)準(zhǔn)品二級譜圖數(shù)據(jù)庫，但很多公共數(shù)據(jù)庫（HMDB、Metlin等）中約有90%的已知代謝物都沒有標(biāo)準(zhǔn)的二級譜圖。即使有二級信息，由于代謝物的離子譜圖可能由不同實(shí)驗室的不同質(zhì)譜儀器打出，儀器的種類、參數(shù)設(shè)置不同，都可能導(dǎo)致同一個代謝物產(chǎn)生的譜圖存在偏差。因此代謝物雖然種類多數(shù)量多，但是鑒定到的物質(zhì)相對較少。

問題9.在檢測兩種物質(zhì)的豐度水平時，代謝組學(xué)獲得的兩種物質(zhì)豐度比值關(guān)系和其他技術(shù)的檢測結(jié)果明顯相反，這是什么原因？

不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)、攜帶的基團(tuán)不同，質(zhì)譜檢測過程中，物質(zhì)的離子化效率、對儀器信號的響應(yīng)等方面可能存在較大差異，結(jié)果就呈現(xiàn)出不同物質(zhì)的質(zhì)譜檢測效率不一致。因此，代謝組數(shù)據(jù)僅適用于不同組別間同一物質(zhì)的比較，不適用于同一樣本內(nèi)部比較不同物質(zhì)的差異。

問題10.代謝組學(xué)與其他組學(xué)相比，有什么優(yōu)勢？

基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會在代謝物水平得到放大；代謝組學(xué)的研究不需進(jìn)行全基因組測序及建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫；

代謝物種類遠(yuǎn)少于基因和蛋白的數(shù)目，每個生物體中代謝產(chǎn)物大約在103數(shù)量級，而最小的細(xì)菌，其基因組中也有幾千個基因，因此，通過代謝組可以更好的定位關(guān)鍵代謝物，開展生物體生理生化機(jī)制研究；

生物體液的代謝物分析可反映機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。