2022年1月，來自華中科技大學同濟醫(yī)學院的程翔團隊在?Advanced Science?雜志上合作發(fā)表了題名為“Aorta Regulatory T Cells with a Tissue-Specific Phenotype and Function Promote Tissue Repair through Tff1 in Abdominal Aortic Aneurysms”的研究論文，該研究利用單細胞測序、單細胞免疫組庫檢測、bulk RNA-seq 等技術，在腹主動脈瘤模型中發(fā)現了一群特殊的主動脈 Treg 細胞，其在腹主動脈瘤發(fā)展進程中逐漸增加，并顯示出獨特的分子表型和組織特異性。后續(xù)小鼠敲除模型的研究結果則提示，該主動脈 Treg 分泌 Tff1 來調節(jié)平滑肌細胞（SMC）的凋亡，而體外實驗則表明 Tff1 通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2通路（ERK 1/2 pathway）抑制 SMC 凋亡。這一發(fā)現揭示了主動脈 Treg 的組織特異性表型和功能，可能為預防腹主動脈瘤發(fā)展提供一個新方向。該研究中單細胞轉錄組測序、免疫組庫測序服務由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Advanced Science

【發(fā)布時間】2022年1月

【影響因子】16.807

【檢測技術】單細胞測序、單細胞免疫組庫檢測、bulk RNA-seq

科學問題

腹主動脈瘤（AAA）的發(fā)病機制目前還不完全清楚。既往研究表明，慢性炎癥在 AAA 發(fā)展進程中起重要作用。AAA 的局部出現是慢性不可控炎癥的結果，深入了解局部炎癥反應，對于打破這種惡性循環(huán)，甚至找到新的治療靶點至關重要。
調節(jié)性 T 細胞（Treg，定義為 CD4+Foxp3+）是一種特殊的 T 細胞亞型，在調節(jié)炎癥反應和維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。既往研究提示，Treg 參與了動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死的調節(jié)。有研究表明， Treg 參與了 AAA 慢性炎癥的調節(jié)，可能是 AAA 治療的潛在靶點。然而，到目前為止，Treg 在 AAA 發(fā)展中的調控作用還沒有完全了解。

研究思路

主要研究結果

1、在 AAA 發(fā)展進程中，高比例 Treg 細胞浸潤主動脈

此前已有研究表明，Treg 細胞在血管緊張素II誘導的 AAA 中發(fā)揮保護作用。所以研究者采用豬胰腺彈性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）誘導的 AAA 模型，通過流式細胞儀分析腹主動脈中 Treg 細胞的動態(tài)變化（圖1 a），發(fā)現在 AAA 發(fā)展進程中，主動脈內 Treg 細胞比例逐漸擴大，術后 14 天達到峰值，28 天保持升高（圖1 b、c）。相比之下，Treg 在脾臟中幾乎沒有變化（圖1 b、c）。而主動脈 CD4+?T 細胞和炎癥細胞的數量均在 AAA 后第 7 天達到高峰，之后下降，這意味著局部炎癥反應得到了控制，可能是因為 Treg 細胞數量的增多。
隨后研究者通過功能缺失和獲得實驗來評估 Treg 在 AAA 模型中的作用，結果發(fā)現 Treg 缺失后，顯著增加了主動脈瘤的直徑，而通過 IL-2 的復合治療后則增加了 Treg 細胞，降低了主動脈瘤的直徑。

結果表明，Treg 在 PPE 誘導的 AAA 發(fā)展進程中具有重要的保護作用。

2、主動脈 Treg 轉錄圖譜顯示出獨特的表型

隨后對 Treg 進行了 bulk RNA-seq，以研究主動脈 Treg 與脾臟、淋巴結等器官的 Treg 的組織特異性表型。數據分析（主成分分析、組間差異分析等）發(fā)現，AAA 小鼠的主動脈 Treg 與其它類型的組織 Treg 有顯著差異（圖2 a、b）。盡管顯示出不同的基因表達譜，但主動脈 Treg 仍然是明顯的 Treg 細胞，表達多個 Treg 特征基因，如高表達 Foxp3、Cd25、Tff1 等，低表達 Tcf7、Lef1 和 Tgfbr2 等（圖2 d、e）。功能富集分析則發(fā)現主動脈 Treg 不再僅僅發(fā)揮免疫調節(jié)作用，它們在 AAA 發(fā)展進程中還參與調節(jié)細胞外基質的功能（圖2 f、g）。
這些結果都提示主動脈 Treg 是一種新的組織 Treg ，與傳統(tǒng)的淋巴 Treg 不同，并具有與組織微環(huán)境相關的特定功能。

3、主動脈 Treg 顯示出克隆擴張并具有獨特的 TCR 克隆
研究者通過流式細胞術表明 AAA 模型中的 Treg 呈現增殖表型（圖3 a）。隨后對 AAA 小鼠主動脈和相應脾臟的 CD4+?細胞進行了單細胞 RNA-seq 測序，并結合免疫組庫 TCR 測序，最終獲得了 41341 個細胞，識別出 17 個亞群，確定了四個 Treg 亞群（圖3 b、c）。根據組織分布，研究者分析了脾臟和主動脈 Treg 的 TCR 克隆情況，與其他組織 Treg 相似，主動脈 Treg 具有獨特的 TCR?克隆表型，只有少數主動脈 Treg 的 TCR?克隆與脾臟 Treg 或主動脈常規(guī) T 細胞（Tconvs，定義為 CD4+Foxp3–?cell）相同（圖3 d），而根據 Ki67 染色結果，主動脈 Treg 克隆擴張比例明顯高于脾臟（圖3 e）。這些結果都顯示在 AAA 中的主動脈 Treg 以克隆擴張為標志。

4、在 AAA 發(fā)展進程中增加的 Treg 主要來自外周募集

接下來，文章繼續(xù)探索 AAA 中 Treg 的來源問題。首先使用 FTY720，S1P1 受體激動劑防止 T 細胞從淋巴器官再循環(huán)到外周部位，結果發(fā)現，主動脈 Treg 的比例和數量明顯減少。接下來，使用轉基因小鼠來跟蹤 AAA 中 Treg 和 Tconvs 的遷移（圖4 a），在 ALN（Axillary lymph node）、PALN（Para-abdominal aortic lymph node）和主動脈瘤中檢測到一組 Kikume-red+?Treg 和 Tconvs （圖4 b、c）。當校正總體循環(huán)模式時，可以清楚地看出 Treg 和 Tconvs 之間的主要差異，是由于 Treg 遷移到受傷的主動脈所造成的（圖4 d）。隨后，文章使用異種共生實驗來確定外周血 Treg 對主動脈 Treg 細胞群體的貢獻程度（圖4 e），基于數據結果，研究者估計，在 AAA 進展期間，募集的 Treg 約占擴大的 Treg 群體的 78%（圖4 e）。最后研究者根據轉移實驗以及 TCR 的相似性結果，表明 AAA 中的 Treg 是外周誘導的 Treg 細胞（peripherally induced Treg，pTreg），由外周組織轉化的 Tconvs 衍生而來。

5、IL-33/ST2 信號軸參與主動脈 Treg 細胞的維持

前期研究發(fā)現，IL-33 和 ST2 在動脈瘤中的表達增加，且 IL-33 主要來源于成纖維細胞。因此，文章進一步探討 ST2 在主動脈瘤的主動脈 Treg 上的表達，并通過增強或阻斷 IL-33/ST2 信號通路來觀察 IL-33/ST2 信號軸在主動脈 Treg 上的作用。在 ST2 缺陷小鼠中，損傷主動脈中的 Treg 數量減少（圖4 f），相比之下，在 AAA WT 小鼠中，外源性給予 IL-33 后，主動脈 Treg 細胞增多，ST2 表達升高（圖4 g）。

綜上所述，這些數據提示 IL-33/ST2 信號軸參與了主動脈 Treg 的維持。

6、類似的 Treg 亞群擴張出現在 CaPO4?誘導的 AAA 模型

為了證實主動脈 Treg 是否廣泛存在，文章用 CaPO4??誘導的 AAA 模型來評估主動脈 Treg 的作用。在該誘導模型中，發(fā)現類似的 Treg 群體在主動脈瘤中積累的現象，并表現出高增殖狀態(tài)（圖5 a、b）。隨后，文章測試了 CaPO4?誘導模型中 Treg 是否也與 PPE 模型中的 Treg 有相同的來源，結果發(fā)現使用 FTY720 可以阻斷 AAA 中 Treg 的增加（圖5 c），該觀察結果表明，外周循環(huán)中的 Treg 池對主動脈瘤中的 Treg 數量貢獻很大。此外，在該模型中檢測了主動脈 Treg 上 Helios 和 Nrp-1 的高表達（圖5 d），提示這是胸腺起源。

接下來測試了 IL-33/ST2 信號軸是否也參與了 CaPO4?誘導的 AAA 中主動脈 Treg 的維持，與脾臟 Treg 相比，主動脈 Treg 高表達了 ST2（圖5 e）。在 ST2 缺陷小鼠中，主動脈 Treg 顯著的減少（圖5 f），而脾臟 Treg 未發(fā)生變化（圖5 g）。重組 IL-33 可以增強 AAA WT 小鼠主動脈中 Treg 的增殖，也增強了 ST2 的表達（圖5 h）。
這些結果表明，IL-33/ST2 信號軸對 CaPO4?誘導的 AAA 模型中主動脈 Treg 的維持是至關重要的，同時也表明，主動脈 Treg 作為一種獨特的群體存在于主動脈瘤中，不依賴于特定的 AAA 模型。

7、主動脈 Treg 優(yōu)先表達 Tff1，抑制 SMC 凋亡，減弱腹主動脈瘤
緊接著，文章分析了主動脈 Treg 的轉錄組數據，發(fā)現胃腸道保護和修復的關鍵肽 Tff1 是主動脈 Treg 與淋巴器官 Treg 的差異表達最高的基因之一（圖6 a）。為了證實 Tff1 在主動脈 Treg 上的表達，文章使用了 RT-PCR 檢測、GEO 公共單細胞數據分析、免疫熒光檢測等方法（圖6 b），都表明 Tff1 在主動脈瘤中由 Treg 產生，可能是一種組織特異性。
之前的研究表明，Tff1 可以抑制平滑肌細胞的凋亡（smooth muscle cell，SMC）是 AAA 最重要的致病機制之一，因此，文章推測 Treg 產生的 Tff1 在 AAA 中具有抗凋亡作用。為了闡明 Treg 衍生的 Tff1 在 AAA 中的作用，并確定其是否影響 SMC 的凋亡，文章使用 Tff1 等位基因（Tff1flox/flox）的小鼠與 Foxp3-cre 小鼠雜交，特異性地消除 Tff1 在 Treg 中的表達（圖6 c），而 Tff1 在小鼠胃中的表達則不受影響（圖6 d）。隨后使用 PPE 誘導 Foxp3cre/creTff1flox/flox?小鼠的 AAA，結果發(fā)現，選擇性敲除 Tff1 后，主動脈 Treg 的保護作用減弱，動脈瘤直徑增大（圖6 e），血管壁介質中彈性蛋白廣泛降解（圖6 f）， SMC 的凋亡增加（圖6 g），假手術組則無明顯差異（圖6 e、g）。隨后，使用 Treg 過繼轉移實驗來進一步支持該結論，即 Treg 表達的 Tff1 在 AAA 的保護中發(fā)揮重要作用。最后使用腺病毒過表達系統(tǒng)來評估 Tff1 在 AAA 中的治療作用，結果如預期，Tff1 處理對AAA 具有保護作用（圖6 h、i）。
綜上所述，這些結果提示 Tff1 可能具有潛在的臨床轉化價值。

8、Tff1 通過激活 ERK1/2 抑制 SMC 凋亡信號通路

接下來文章進一步研究 Tff1 是否在體外對小鼠原代血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）有直接作用。在培養(yǎng)的 VSMC 中，Tff1 以濃度和孵育時間依賴性的方式減弱 VSMC 的凋亡（圖7 a）。根據前期報道，細胞外信號調節(jié)激酶 1/2 通路（ERK 1/2 pathway），AKT 和 NF - B 信號通路在 SMC 生存方面發(fā)揮了重要作用，因此研究者推測 Tff1 通過 ERK1/2 信號通路抑制 VSMC 凋亡。通過 Western Blotting，發(fā)現 Tff1 組中顯著提高了 VSMC 中磷酸化 ERK1/2 （pERK1/2）的蛋白水平（圖7 b、c），而細胞凋亡的關鍵因子 procaspase-9 在 Tff1 組中則出現顯著的表達降低，procaspase-8 水平則無變化（圖7 b、c）。
為了進一步證實 ERK1/2 通路在 Tff1 介導的 VSMC 存活中的作用，在 Tff1 存在的情況下，對 VSMC 進行 ERK1/2 抑制劑（SCH772984）或不使用 ERK1/2 抑制劑的處理。結果表明，Tff1 顯著增加了 ERK1/2 的磷酸化，降低了凋亡的關鍵因子的比值，而 ERK1/2 抑制劑可以顯著逆轉了這些變化（圖7 d、e），通過流式細胞術也表明 ERK1/2 抑制劑可以顯著增加 VSMC 凋亡，并消除 Tff1 的保護作用（圖7 f）。因此，結果表明 Tff1 通過激活 ERK1/2 信號通路抑制 VSMC 的內在凋亡。

總結

越來越多的文獻表明，Treg 代表了一種高度復雜和異質性的淋巴細胞譜系，在其駐留的組織中具有特殊的功能。在這里，文章報道了一組獨特的小鼠 AAA 病變特異性的 Treg 細胞，它具有獨特的分子表型和 TCR 克隆表型，并在維持血管組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了重要作用，超出了在 AAA 中抑制炎癥的既定作用。研究結果發(fā)現，在 AAA 進展期間，Treg 對血管結構和功能完整性的保護能力是通過 Tff1 基因激活 ERK1/2 信號通路從而抑制 SMC 凋亡來實現的。

參考文獻：Li J, Xia N, Li D, et al. Aorta Regulatory T Cells with a Tissue‐Specific Phenotype and Function Promote Tissue Repair through Tff1 in Abdominal Aortic Aneurysms.?Advanced Science, 2022: 2104338.