腎細(xì)胞癌（RCC）是一種常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)疾病。目前，手術(shù)是腎癌的主要治療方法；免疫療法并沒(méi)有像預(yù)期那樣有效。因此，了解腫瘤免疫微環(huán)境（TME）中的機(jī)制，并探索新的免疫治療靶點(diǎn)被認(rèn)為是重要的。最近的研究表明，自噬可以影響腎細(xì)胞癌的免疫環(huán)境，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

1. LAPTM4B在ccRCC組織中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值

從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲取了溶酶體基因集（121個(gè)基因）和自噬基因集（36個(gè)基因）。為了比較溶酶體和自噬基因，作者獲取了共同的基因LAPTM4B（圖1A）。作者基于TCGA的534名患者分析了LAPTM4B表達(dá)水平和生存率之間的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)LAPTM4B表達(dá)水平低的患者比表達(dá)水平高的患者有更好的總體生存率（圖1B）。

圖1 LAPTM4B的表達(dá)及其在ccRCC組織中的預(yù)后價(jià)值

據(jù)證實(shí)，腫瘤組織中LAPTM4B的表達(dá)高于正常組織。在本研究中，使用尿液存活素方法檢測(cè)LAPTM4B含量，并用其構(gòu)建了一個(gè)腎細(xì)胞癌的診斷模型，AUC為0.920。然而，在本研究中并未進(jìn)一步討論LAPTM4B在ccRCC中的具體機(jī)制，盡管這是作者研究的補(bǔ)償和研究重點(diǎn)。為了探索LAPTM4B在不同級(jí)別的ccRCC中的表達(dá)情況，基于免疫印跡法，分析了10名患者（Fuhrman III/IV：3名患者，F(xiàn)uhrman I/II：7名患者）的ccRCC組織和相配的正常腎組織中LAPTM4B的蛋白水平。有趣的是，結(jié)果表明，F(xiàn)uhrman III/IV級(jí)ccRCC組織中LAPTM4B的蛋白水平高于相配的正常腎組織（圖1C）。相比之下，F(xiàn)uhrman I/II級(jí)ccRCC組織中LAPTM4B的蛋白水平低于相配的正常腎組織。

2. 功能富集

功能富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因（DEGs）可以參與細(xì)胞增殖和死亡相關(guān)的通信，并調(diào)節(jié)免疫相關(guān)和檢查點(diǎn)PD-L1相關(guān)的途徑（圖2）。根據(jù)GSEA分析結(jié)果，DEGs可以參與細(xì)胞增殖、死亡、細(xì)胞周期等途徑（圖3A、B）。為了進(jìn)一步比較兩組之間細(xì)胞信號(hào)通路活性的差異，基因集GSVA結(jié)果顯示，與癌細(xì)胞增殖和分裂相關(guān)的TNFA-NKFB、JAK-STAT3、P53等途徑顯著增加（圖4C）。KEGG-GSVA富集結(jié)果也證實(shí)，與癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的途徑在高組中，如細(xì)胞周期、mTOR、VEGF和JAK-STAT信號(hào)通路，顯著增加（圖4D）。

圖2 GO/KEGG功能富集的差異表達(dá)基因（DEGs）

圖3 GSEA功能富集分析差異表達(dá)基因（DEGs）和GSVA功能富集分析兩組

圖4 對(duì)534個(gè)TCGA腫瘤樣本的免疫細(xì)胞矩陣和豐度進(jìn)行評(píng)估

3. 免疫浸潤(rùn)和檢查點(diǎn)的定量評(píng)估

基于ssGSEA免疫矩陣算法，作者觀察到高LAPTM4B表達(dá)組和低LAPTM4B表達(dá)組之間的免疫微環(huán)境評(píng)分差異。高組腫瘤組織的基質(zhì)評(píng)分高于低組（p < 0.001）。高組腫瘤組織的免疫評(píng)分環(huán)境較其他腫瘤組織更差（p < 0.001）。然而，兩組之間的估計(jì)評(píng)分和腫瘤純度沒(méi)有顯著差異（圖4A）。為了進(jìn)一步探索兩組之間特定的免疫細(xì)胞差異，作者使用估計(jì)算法評(píng)估了兩組的免疫成分。圖4B、C顯示了兩組中22個(gè)免疫細(xì)胞的成分和比例。兩組之間的比較（圖4D）顯示出免疫細(xì)胞之間的顯著差異，低組中的CD8 T細(xì)胞顯著高于高組，而與癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的M2巨噬細(xì)胞在高組中顯著高于低組。免疫細(xì)胞相關(guān)性研究結(jié)果顯示（圖4E，F(xiàn)），CD8 T細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。LAPTM4B與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性分析顯示，LAPTM與每種免疫細(xì)胞都存在相關(guān)性（圖5）；LAPTM4B與與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的M2巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)。LAPTM4B與免疫檢查點(diǎn)基因之間的相關(guān)性分析顯示，CD44與VTCN1、TNFSF15、CD276和CD44呈正相關(guān)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其他基因呈負(fù)相關(guān)。

圖5 LAPTM4B與免疫細(xì)胞的相關(guān)性

4. 對(duì)結(jié)直腸癌單個(gè)細(xì)胞中通路活性的評(píng)估

對(duì)兩個(gè)ccRCC的單細(xì)胞RNA測(cè)序樣本進(jìn)行了Harmony整合（圖6A），并使用PCA、tSNE和UMAP方法進(jìn)行降維和聚類(lèi)。使用默認(rèn)參數(shù)（logfc.threshold = 0.25）來(lái)識(shí)別每個(gè)聚類(lèi)中的差異標(biāo)記基因（圖6C）。在使用SingleR算法進(jìn)行注釋后，獲得了8種細(xì)胞類(lèi)型（圖6B、C）。LAPTM4B主要在干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)（圖6D）?；贙EGG基因集的AUC活性算法結(jié)果顯示，溶酶體通路在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中的活性高于其他亞群（圖6E）。然而，與自噬相關(guān)的通路的活性在NK細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞中相對(duì)較高（圖6F）。

圖6 單細(xì)胞通路活性評(píng)估

5. LAPTM4B的敲除抑制了RCC的生長(zhǎng)

為了研究LAPTM4B在腎細(xì)胞癌中的作用，作者進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了LAPTM4B沉默后ccRCC細(xì)胞的增殖情況。作者轉(zhuǎn)染了兩種LAPTM4B表達(dá)強(qiáng)的細(xì)胞系（786-O和ACHN）與LAPTM4B-shRNA慢病毒。在shRNA慢病毒感染3天后，通過(guò)qRT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了LAPTM4B的表達(dá)；結(jié)果顯示，與shCtrl細(xì)胞相比，shLAPTM4B細(xì)胞中LAPTM4B的表達(dá)明顯降低（圖7A、B）。為了研究LAPTM4B對(duì)細(xì)胞增殖和存活的影響，作者使用Celigo圖像細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和MTT實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，shLAPTM4B細(xì)胞中786-O和ACHN細(xì)胞的數(shù)量明顯低于shCtrl細(xì)胞（圖7E-H）。此外，如圖7I、J所示，shLAPTM4B細(xì)胞的OD值低于shCtrl細(xì)胞。數(shù)據(jù)表明，LAPTM4B對(duì)腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有貢獻(xiàn)。

圖7 LAPTM4B在ccRCC細(xì)胞增殖中的作用

6. LAPTM4B的敲除引發(fā)了細(xì)胞凋亡

為了評(píng)估LAPTM4B是否參與了RCC的凋亡，如圖8A、B所示，LAPTM4B被敲除后，兩種細(xì)胞中的caspase 3/4活性顯著增加（p < 0.0001），與shCtrl細(xì)胞相比。LAPTM4B的敲除導(dǎo)致786-O細(xì)胞中凋亡率顯著增加，而shCtrl細(xì)胞中的凋亡率較低（p < 0.0001）。

圖8 LAPTM4B的敲除引發(fā)細(xì)胞凋亡

總結(jié)

通過(guò)評(píng)估單個(gè)細(xì)胞中的通路活性，作者發(fā)現(xiàn)在所有細(xì)胞類(lèi)型中，自噬活性的表達(dá)沒(méi)有顯著差異。相反，溶酶體活性在未成熟的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中更為明顯，這可能與免疫細(xì)胞的明顯效應(yīng)有關(guān)。然而，LAPTM4B的表達(dá)在干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中更為明顯，但在巨噬細(xì)胞中并不明顯，這也是本研究的局限之一。這種現(xiàn)象可能歸因于作者的單細(xì)胞數(shù)據(jù)來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)，樣本量較小，并且由于缺乏多樣本驗(yàn)證而存在實(shí)驗(yàn)誤差。為了克服這個(gè)局限，可以在臨床實(shí)踐中使用大樣本測(cè)序樣本來(lái)驗(yàn)證結(jié)果，以改進(jìn)LAPTM4B在腎癌中的機(jī)制?？傊?，LAPTM4B是腎癌發(fā)展的不利因素。針對(duì)LAPTM4B的靶向治療和對(duì)RCC患者的早期干預(yù)可以幫助改善他們的生存狀況和生活質(zhì)量。