每個人都有自己養(yǎng)細胞的習(xí)慣和步驟，此篇僅用來記錄我搞細胞的步驟和注意事項

傳代

準(zhǔn)備工作：

1.超凈臺紫外照射1h，中途把培養(yǎng)基，PBS，胰酶等噴75酒精后放進超凈臺一起照紫外

2.打開超凈臺，玻璃拉到指定位置，3min自凈（期間觀察細胞狀態(tài)）

3.75酒精對手部和試驗臺進行消毒（袖口也可以適當(dāng)消毒）

4.將槍頭盒，移液槍，裝有酒精棉球的藍蓋瓶噴酒精后放入超凈臺（所有進入超凈臺的東西均需酒精消毒）

5.用酒精棉球擦拭所有需要用到的試劑瓶口（鑷子夾緊，旋轉(zhuǎn)幾周，封口膜開前開后都要擦拭）

傳代開始：

將細胞從培養(yǎng)箱拿出，放進超凈臺（可以75酒精消毒，但需蓋緊，防止酒精進入）

總原則：為了避免污染，非必要不打開皿蓋?。。。。。。。。。。。。?/span>

1.打開皿蓋（將皿蓋盡量放到自己接觸不到的地方）用移液器或吸痰器將廢液吸取干凈

2.加入隨便2-3ml的PBS洗兩次（貼壁細胞，不要把PBS直接打到細胞上，槍頭對著皿壁打）

????PBS：磷酸緩沖鹽溶液，主要成分為Na??HPO???、KH?PO???、NaCl和KCl，由于Na?HPO???和KH?PO???它們有二級解離，緩沖的pH值范圍很廣；而NaCl和KCl主要作用為水鹽平衡，不使用蒸餾水的原因在于水會破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)和生物特性。不使用生理鹽水的原因在于它不能夠調(diào)整PH值。

3.加入1ml胰酶消化細胞，每種細胞的消化時長不一致，要自己摸索一下，拍打皿壁（皿底有一層薄霧即為貼壁細胞），在顯微鏡下觀察，細胞簌簌落下即可，加入2ml培養(yǎng)基中和，將槍頭吸滿液體，從下往上緩慢打出，直至皿底看不見薄霧變光滑，將液體移入離心管中，1000-1500rpm，3-5min即可

期間準(zhǔn)備好培養(yǎng)皿（9cm皿）放入8-9ml培養(yǎng)基

4.棄去離心管上清，加入1-2ml培養(yǎng)基重懸（輕輕吹打重懸即可），移入新皿中

5.進行混勻，有8字和十字兩種，看自己喜歡選擇，然后放入培養(yǎng)箱中

細胞不應(yīng)放在室溫太久，培養(yǎng)基顏色只能表示培養(yǎng)基酸堿性，紫色呈堿性，對細胞有損傷

當(dāng)它變黃的時候就說明營養(yǎng)物質(zhì)早就耗盡了，每隔2-3天換一次液

后續(xù)工作：

將所有自己的東西帶走（公共超凈臺的話）試劑等需要封口膜封死，槍頭盒等也需要蓋緊，都搞好才能從超凈臺拿出來，將廢液等倒到指定位置，然后酒精棉球擦桌子，然后關(guān)上打開紫外即可

凍存

準(zhǔn)備工作同傳代

凍存開始? 步驟123同傳代

4.棄去離心管上清，加入1-2ml凍存液重懸（輕輕吹打重懸即可），移入凍存管中

5.對于即用型無血清細胞凍存液來說，可以直接凍存于-80℃冰箱，長期保存（>5年），不需要程序性降溫。24h后可轉(zhuǎn)移液氮罐中。

轉(zhuǎn)移過程：

一般液氮罐操作，一提有很多盒，如果要找其中某盒的東西，時間超過30s-1min，就需要先準(zhǔn)備一個泡沫箱，從液氮罐取一點液氮，倒入泡沫箱。

把整提拿出來，拿出需要查找的那盒，放入泡沫箱，把整提先放回去，然后再對泡沫箱中的那盒樣本進行查找整理等，弄完之后，再把整提拿出來，把這個盒子放進去，趕緊把整體放回

后續(xù)工作同傳代

復(fù)蘇

準(zhǔn)備工作同傳代

總原則：慢凍速溶

復(fù)蘇開始

1.準(zhǔn)備好培養(yǎng)皿（9cm皿）放入8-9ml培養(yǎng)基

2.將凍存管從液氮或-80冰箱取出，放在37度水浴鍋中，一分鐘速溶，期間手一直在晃動震蕩

3.身邊人復(fù)蘇有好幾種方法，我總結(jié)了一下

a.將解凍的細胞直接吸取加入培養(yǎng)基中，放進培養(yǎng)箱

b.將解凍的細胞直接1000rpm3-5min離心，槍吸走上清，重懸加入培養(yǎng)基中

c.將解凍的細胞置于離心管中并加入2-3ml培養(yǎng)基一起離心，棄上清重懸加入培養(yǎng)基中

我覺得：還是要根據(jù)自己細胞的狀態(tài)來確定那種方式更好，b方法我覺得有點冒險，a的話凍存液其實會毒害細胞的，我看即用型細胞凍存液不含動物來源性蛋白，不含血清，含DMSO、葡萄糖等各種細胞營養(yǎng)成分，DMSO還是對細胞有傷害的

后續(xù)工作同傳代