前言

Science子刊來了！近日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院檢驗科陳福祥教授團隊與美國路易斯維爾大學醫(yī)學院免疫、腫瘤與生物醫(yī)學中心嚴俊教授合作在Science Advances（IF:14.136）發(fā)表轉(zhuǎn)錄因子c-Maf通過調(diào)節(jié)代謝途徑調(diào)控γδ T17細胞發(fā)揮效應(yīng)功能的相關(guān)成果。陳旭博士為該文章的第一作者，歐易生物提供了該項目單細胞轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)工作。

材料：2例OSCC腫瘤組織；2例癌旁

期刊：Science Advances

發(fā)表時間：2022年5月

方法：歐易生物10× Genomics scRNA-seq

研究背景和研究目的

γδ T 在維持小鼠和人組織穩(wěn)態(tài)以及宿主病原體防御方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，根據(jù)分泌的細胞因子不同，γδ T 細胞主要可以分為分泌IL-17的γδ T17細胞和分泌IFN-γ的γδ T1細胞，γδ T17在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤微環(huán)境中具有促炎功能。有研究報道，在小鼠中轉(zhuǎn)錄因子c-Maf對于γδ T17細胞的生成必不可少。然而，c-Maf在人γδ T17細胞生成中的作用及其在人類疾病中的潛在作用尚不清楚。此外，研究者發(fā)現(xiàn)γδ T1和γδ T17具有不同的代謝途徑，而代謝又與轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的分子信號一起協(xié)調(diào)細胞發(fā)揮相應(yīng)功能，但是轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的細胞代謝復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)如何針對γδ T 細胞進行調(diào)節(jié)目前尚不清楚。因此，這篇文章主要探究c-Maf在γδ T17代謝調(diào)節(jié)中的具體作用機制，以期為γδ T17定向分化的機制提供新的線索。

內(nèi)容概述

作者首先研究了CD27 γδ T1與CD27 γδ T17細胞之間的代謝差異，接著針對性抑制代謝通路證明它們對于兩種細胞效應(yīng)功能的影響。作者進一步探究代謝通路中的系列限制酶對兩類γδ T分泌細胞因子的影響，找到CD27和CD27 γδ T 細胞的代謝檢查點——IDH2，更進一步發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子c-Maf調(diào)節(jié)IDH2活性，且通過構(gòu)建敲除c-Maf小鼠模型驗證該轉(zhuǎn)錄因子的重要性。除此之外，作者針對OSCC患者癌和癌旁組織進行單細胞測序，結(jié)果表明c-Maf在人類疾病中通過調(diào)控γδ T17代謝重編程發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)功能。

研究背景和研究目的

1.CD27 γδ T 細胞與CD27 γδ T 細胞代謝差異

T細胞效應(yīng)功能差異與特殊代謝途徑相關(guān)。CD27是區(qū)分分泌IFN-γ的γδ T 細胞(CD27γδ T1)與分泌IL-17的γδ T 細胞(CD27 γδ T17)的功能標記物。因此，作者接下來利用CD27作為分子標記物探究CD27 γδ T1與CD27 γδ T17之間的代謝差異。首先，作者發(fā)現(xiàn)，相比于CD27 γδ T17，CD27 γδ T1高表達葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1 (glucose transporter 1, Glut1)，通過2-NBDG示蹤發(fā)現(xiàn)CD27 γδ T1中葡萄糖攝取量也更高 (圖1, A and B)，表明CD27 γδ T1主要利用糖酵解代謝途徑。相反，CD27 γδ T17更高表達谷氨酸代謝相關(guān)代謝酶，例如谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)和谷氨酸脫氫酶1(glutamate dehydrogenase 1, GLUD1) (圖1C)，說明CD27 γδ T17可能依賴谷氨酰胺水解代謝途徑以發(fā)揮效應(yīng)功能。之前的研究表明，γδ T17主要利用氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)途徑，提示三羧酸(TCA)循環(huán)在γδ T17細胞中的重要性。

為了進一步分析γδ T 細胞的代謝途徑，作者利用C標記的葡萄糖進行穩(wěn)定同位素分析代謝組學(stable isotope-resolved metabolomics, SIRM)分析 (圖1D)。分析結(jié)果顯示，CD27 γδ T1中丙酮酸和乳酸等同位素標記物增加，揭示其以糖酵解為主要代謝途徑 (圖1D)，而在CD27 γδ T17中，同位素標記物如順式烏頭酸、α-酮戊二酸、蘋果酸和谷氨酸等主要參與TCA循環(huán)(圖1D)，該結(jié)果進一步說明CD27γδ T1與CD27 γδ T17之間的代謝途徑存在差異。

由于OXPHOS發(fā)生在線粒體中，作者通過MitoTracker Green/Red染色觀察這兩種細胞的線粒體，發(fā)現(xiàn)兩者之間線粒體完整性并無差異 (圖1E)，而通過mitoSOX Red染色發(fā)現(xiàn)，CD27γδ T1中線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mitoROS)表達水平更高 (圖1F)，且流式分析表明這種差異并非由細胞大小所致 (圖1F)?？傊@些結(jié)果表明，CD27 γδ T17和CD27γδ T1之間存在代謝和線粒體功能差異。

圖1| CD27和CD27- γδ T 細胞代謝差異

2、CD27 γδ T 細胞與CD27γδ T 細胞效應(yīng)功能受不同代謝途徑的調(diào)控

為了進一步驗證兩種細胞因代謝差異所導(dǎo)致的效應(yīng)功能差異，作者使用小分子抑制劑阻斷不同的代謝通路以檢測對分泌細胞因子的影響。CD27 γδ T 細胞主要分泌IL-17，而CD27 γδ T 主要分泌IFN-γ (圖2A)。2-脫氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose, 2-DG)是一種競爭性抑制葡萄糖代謝的葡萄糖類似物，經(jīng)2-DG處理后，CD27 γδ T17細胞的IL-17分泌水平?jīng)]有明顯改變，而CD27 γδ T1細胞分泌的IFN-γ顯著降低，且呈劑量依賴性 (圖2B)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，通過草酸鹽(oxalate, OXA)靶向抑制丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)，兩種細胞因子的分泌均下降，表明這兩種細胞存在共同的代謝途徑 (圖2C)。AGI抑制異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)兩種細胞中的細胞因子分泌量降低 (圖2D)，表明IDH等代謝酶在γδ T 發(fā)揮功能中的重要作用?？偟膩碚f，CD27 γδ T17細胞與CD27 γδ T1細胞發(fā)揮效應(yīng)功能依賴于這些差異或者共享的代謝途徑。

圖2 | 抑制代謝途徑影響CD27+和CD27 γδ T 細胞分泌功能性細胞因子

3、IDH2作為γδ T 發(fā)揮效應(yīng)功能的代謝檢查點

限速酶在代謝通路中起著關(guān)鍵作用。作者接下來針對參與糖酵解以及TCA循環(huán)的一系列限速酶在兩種細胞中的表達進行研究，包括己糖激酶1 (hexokinase 1, HK1)、丙酮酸脫氫酶激酶1 (pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1)、丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2, PKM2)、乳酸脫氫酶A (lactate dehydrogenase A, LDHA)、IDH1和IDH2。PCR和WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IDH2在CD27 γδ T17細胞中的表達高于在CD27 γδ T1中的表達 (圖3A and B)。C標記示蹤實驗表明，與CD27 γδ T17細胞相比，CD27γδ T1細胞中異檸檬酸鹽向α-KG的轉(zhuǎn)化顯著減少，這表明CD27 γδ T1中檸檬酸鹽向α-KG的代謝被中斷 (圖3C and D)。

為了證明IDH2在調(diào)節(jié)γδ T 效應(yīng)功能中的作用，使用siRNA沉默CD27 γδ T17中的IDH2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD27 γδ T17中的IL-17顯著減少 (圖3E)。此外，經(jīng)IDH2 siRNA處理之后，c-Maf和Rorc的mRNA表達水平也顯著降低 (圖3F)，而在CD27γδ T1中，經(jīng)過慢病毒轉(zhuǎn)染IDH2處理之后發(fā)現(xiàn)，IFN-γ分泌表達下降 (圖3G)。作者還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中直接添加α-KG同樣能夠抑制CD27γδ T1中IFN-γ的產(chǎn)生 (圖3H)。這些數(shù)據(jù)表明，IDH2在γδ T 細胞中作為效應(yīng)功能的代謝檢查點。

圖3 | IDH2是CD27+和CD27- γδ T?細胞的代謝檢查點

4、轉(zhuǎn)錄因子c-Maf調(diào)節(jié)IDH2活性從而調(diào)控γδ T 細胞中IL-17的生成

據(jù)報道，轉(zhuǎn)錄因子c-Maf 在原代CD27 γδ T17及其祖細胞中特異性表達。此處作者利用流式以及PCR驗證了c-Maf在CD27 γδ T17中表達，而在CD27γδ T1中不表達(圖4A and B)。經(jīng)過c-Maf特異性抑制劑NIV處理之后，CD27 γδ T17細胞中c-Maf、RORγt和IDH2表達降低，IL-17減少 (圖4C)。為了排除c-Maf抑制劑NIV的脫靶效應(yīng)，作者構(gòu)建了敲除小鼠Rorc-cre; c-Maff/f，并驗證了敲除效果(圖4D)。與抑制劑處理結(jié)果一致，敲除鼠中IDH2表達顯著降低 (圖4E)，而GLS和GLUD1的表達水平?jīng)]有改變 (圖4E)。

為了進一步闡明其中的機制，作者使用預(yù)測軟件針對c-Maf在IDH2啟動子區(qū)域的結(jié)合位點進行篩選，得到兩個可能的結(jié)合位點，并進一步針對c-Maf進行ChIP檢測，分析IDH2啟動子活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-Maf直接結(jié)合在IDH2啟動子的兩個預(yù)測區(qū)域，而且與之前報道一致，c-Maf也與Rorc啟動子區(qū)結(jié)合 (圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子c-Maf通過與IDH2啟動子區(qū)結(jié)合直接調(diào)控IDH2活性。

圖4 | 轉(zhuǎn)錄因子c-Maf調(diào)節(jié)CD27- ?γδ T 細胞中IDH2的活性

5、γδ T 細胞中c-Maf的缺乏能夠減少肺癌的轉(zhuǎn)移

肺中的γδ T17細胞在促進轉(zhuǎn)移性肺癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用。接下來，作者研究了c-Maf在轉(zhuǎn)移性肺癌發(fā)展中的作用。通過尾靜脈注射向Rorc-cre; c-Maff/f小鼠及對照小鼠中輸注GFP標記的肺癌細胞系LLC。注射14d后，通過流式分析荷瘤情況，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠中腫瘤細胞LLC明顯減少 (圖5A)。另外，與對照小鼠相比，敲除小鼠生存周期延長(圖5B)。同時，作者針對肺的免疫表型進行檢測，發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比，敲除鼠肺中γδ T 細胞的占比，尤其是γδ T17細胞的占比顯著降低，而產(chǎn)生IFN-γ的γδ T1細胞占比顯著升高 (圖5C)。然而，CD4和CD8 T細胞中IFN-γ的產(chǎn)生沒有差異 (圖5D)。

此外，兩種小鼠肺部CD45免疫細胞和CD11b髓系細胞的總量占比也沒有顯著差異 (圖5E)。除肺癌外，作者還使用轉(zhuǎn)移性黑色素瘤B16F10模型來驗證這一結(jié)果，結(jié)果也表明Rorc-cre; c-Maf小鼠的存活率延長 (圖5F)。這些結(jié)果證明γδ T17細胞在轉(zhuǎn)移性肺癌中的關(guān)鍵作用，并提示c-Maf是癌癥免疫療法的潛在治療靶標。

圖5 | 敲除γδ T 細胞中c-Maf能夠延長轉(zhuǎn)移性肺癌總生存期

6、c-Maf調(diào)控人γδ T17細胞，并與口腔癌進展相關(guān)

以上研究結(jié)果已經(jīng)表明轉(zhuǎn)錄因子c-Maf調(diào)控小鼠的γδ T17細胞，而c-Maf在人γδ T17細胞中的作用尚不明確。健康人外周血中γδ T 細胞的占比小于10%，這些γδ T細胞主要由Vδ2 組成。外周血中的原代γδ T 細胞分泌的IL-17水平可以忽略不計，主要產(chǎn)生的是IFN-γ。有報道稱，人γδ T17細胞表達CCR6，但只有少部分CCR6 γδ T 細胞(γδ T CCR6)在外周表達。

作者針對γδ T17細胞進行極化處理，發(fā)現(xiàn)γδ T 細胞在極化后擴增并產(chǎn)生更多的IL-17，而產(chǎn)生IL-17的γδ T細胞僅限于CCR6亞群 (圖6A)。此外，與γδ T相比，γδ T中IL-17A表達水平也更高 (圖6B)。IDH2 siRNA干擾顯著降低γδ T中IL-17的產(chǎn)生 (圖6C)。作者還觀察到γδ T在mRNA和蛋白水平上均高表達c-Maf (圖6D)。通過NIV抑制c-Maf，人γδ T顯示IL-17生成減少 (圖6E)。

圖6 | 敲除γδ T細胞中c-Maf能夠延長轉(zhuǎn)移性肺癌總生存期

為了研究γδ T17在人類疾病中的調(diào)控作用，作者針對口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)患者進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的γδ T 細胞浸潤在OSCC組織中，并且部分γδ T 細胞表達CCR6，以及這些來自O(shè)SCC的CCR6 γδ T 細胞也分泌了相當數(shù)量的IL-17 (圖7A)。為了進一步探索人類OSCC組織中的γδ T 細胞，作者針對OSCC患者癌和癌旁組織進行了單細胞測序。通過scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)了5種不同的γδ T 亞群 (圖7B)。其中，亞群1和4高表達IFNG和TBX21 (圖7C)，提示這兩個亞群為γδ T1細胞；亞群5高表達c-MAF、CCR6、IL-17A和IL-22，而IFNG和TBX21表達水平較低 (圖7C)，表明亞群5代表人γδ T17細胞。從分樣本展示結(jié)果來看，OSCC組織中γδ T17細胞更多(圖7B)。

針對代謝相關(guān)基因進行分析，亞群5中IDH1和IDH2在OSCC中高表達 (圖7D)。與此相反，與癌旁組織相比，OSCC組織亞群1中IDH1和IDH2的表達水平降低。進一步使用公共數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，具有低c-Maf表達和高γδ T 細胞浸潤的頭頸部鱗狀癌(head neck squamous carcinoma, HNSC)患者的總生存率顯著提高 (圖7E)。這些數(shù)據(jù)表明c-Maf在介導(dǎo)人γδ T17細胞代謝重編程中的關(guān)鍵作用，并進一步提示靶向γδ T 細胞中的c-Maf可能成為腫瘤新治療手段。

圖7 | 人口腔組織中的γδ T17細胞

研究結(jié)論

作者證明了γδ T17和γδ T1通過不同的代謝途徑發(fā)揮效應(yīng)功能，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子c-Maf在γδ T17的細胞代謝中起關(guān)鍵作用。其中，c-Maf直接與IDH2啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)IDH2活性，從而直接調(diào)控限速酶IDH2參與調(diào)控細胞代謝。作者通過單細胞測序以及公共數(shù)據(jù)庫分析，進一步證明在人類疾病中c-Maf通過調(diào)控γδ T17代謝重編程發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)功能，為未來腫瘤免疫治療提供了新靶點。

致謝

特別致謝歐易生物技術(shù)工程師祖啟東、姚曉華和子清珍在分析中提供的幫助。

歡迎百度搜索歐易生物——訪問歐易生物官網(wǎng)——了解10× Genomics scRNA-seq、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

猜你想看

1、免疫研究工具天花板—IOBR包說明書來啦~

2、IJBM │ “無懼遺忘”酵母雙雜交研究阿爾茨海默癥的病理機制

3、ACTA PHARM SIN B | 空間分辨代謝組學揭示糖尿病腎病中具有組織異質(zhì)性的代謝重編程

4、治療炎癥性腸病竟然靠它！Cell子刊揭示腸道微生物菌群的多組學研究

原創(chuàng)聲明：本文由歐易生物(OEBIOTECH)學術(shù)團隊報道，本文著作權(quán)歸文章作者所有。歡迎個人轉(zhuǎn)發(fā)及分享，未經(jīng)作者的允許禁止轉(zhuǎn)載。