2023年9月，中南大學(xué)羅湘杭團隊在Cell Metabolism（IF=29）發(fā)表題為“Bone marrow immune cells respond to fluctuating nutritional stress to constrain weight regain”，該研究對通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，確定了一種獨特的骨髓來源的代謝記憶免疫細胞群，可以靶向?qū)狗逝帧?/p>

題目：Bone marrow immune cells respond to fluctuating nutritional stress to constrain weight regain

發(fā)表期刊：Cell Metabolism

影響因子：29

發(fā)表年月：2023年9月

材料：正常食物飲食（ND組）、高脂飲食（HFD組）、循環(huán)HFD組（Cyc組）小鼠的骨髓（BM）免疫細胞

方法：10×Genomics scRNA-seq

肥胖是一種世界性的流行病，導(dǎo)致代謝紊亂的發(fā)病率增加，包括胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓和各種形式的癌癥。目前，肥胖的主要治療方法包括生活方式和藥物干預(yù)，以及減肥手術(shù)。雖然許多這些治療最初是有效的，但維持10%以上的體重減輕是很困難的。大多數(shù)人在體重明顯減輕后，體重容易反彈。因此，控制體重反彈對治療肥胖患者至關(guān)重要。骨髓(BM)是循環(huán)和組織浸潤免疫細胞的關(guān)鍵儲存庫。研究表明，肥胖可引起B(yǎng)M微環(huán)境的改變，導(dǎo)致BM顯著重塑，免疫細胞數(shù)量和功能發(fā)生改變。肥胖是如何影響B(tài)M定位的免疫細胞并相互調(diào)節(jié)體重恢復(fù)的，目前尚不清楚。

Result 1波動的營養(yǎng)壓力使BM免疫細胞具有抗肥胖特性

CD45.1小鼠喂食高脂飲食(HFD) 5周以誘導(dǎo)肥胖，然后再喂食3周的高脂飲食(HFD組)或切換到3周的正常食物飲食(ND)來減肥(循環(huán)HFD組，以下簡稱Cyc組)，以連續(xù)8周飼喂ND的小鼠為對照組(ND組)。然后從ND組、HFD組和Cyc組小鼠中收集BM免疫細胞，轉(zhuǎn)移到野生型(WT) CD45.2小鼠中，重組5周后，受體小鼠體重全部恢復(fù)，重組成功。與移植ND或HFD小鼠的腦源性免疫細胞相比，移植Cyc小鼠的腦源性免疫細胞的受體小鼠體重恢復(fù)明顯較低。移植了Cyc小鼠BM免疫細胞的小鼠表現(xiàn)出葡萄糖耐量（GTT）改善，胰島素敏感性（ITT）增強，組織重量減少和更小的脂肪細胞。此外，從移植了Cyc小鼠來源的BM免疫細胞的小鼠中收集的棕色脂肪組織(BAT)和腹股溝WAT (iWAT)顯示，與ND組或HFD組的BM免疫細胞重建的小鼠相比，UCP1和產(chǎn)熱基因(UCP1和Ppargc1a)的表達增強，揭示了Cyc小鼠來源的BM免疫細胞在促進脂肪產(chǎn)熱方面的驚人作用。飲食改變會導(dǎo)致體重減輕， BM免疫細胞通過增加受體小鼠的能量消耗以維持主要代謝穩(wěn)態(tài) (圖1)。

圖1 波動的營養(yǎng)壓力使BM免疫細胞具有抗肥胖特性

Result 2 scRNA-seq揭示了減肥后小鼠和人類BM中干細胞樣CD7+單核細胞的積累

從ND、HFD和Cyc組小鼠中收集BM免疫細胞，并進行scRNA-seq。在HFD和Cyc小鼠的BM中，骨髓細胞（包括單核巨噬細胞和中性粒細胞）的比例顯著升高，而淋巴細胞（包括B細胞、T細胞和NK細胞）的比例顯著降低。這些結(jié)果與肥胖相關(guān)的骨髓免疫細胞轉(zhuǎn)移一致。單核細胞和巨噬細胞進一步分為6個cluster，其中cluster 5和cluster 6在Cyc小鼠中分別表現(xiàn)出明顯的增加和減少。擬時序分析結(jié)果顯示，從普通髓系祖細胞(CMPs)和多祖細胞(MPPs)，單核細胞和巨噬細胞的前體，逐漸過渡到cluster 5和最終的其他cluster。SCENIC分析顯示，Klf4、E2f1和Tfdp1均與干細胞穩(wěn)態(tài)和細胞周期相關(guān)，是cluster 5的前3位轉(zhuǎn)錄因子。CD7和Flt3鑒定為cluster 5的top marker基因。研究者將cluster 5定義為CD7+單核細胞。飲食誘導(dǎo)的骨髓CD7+單核細胞具有干細胞樣特征?？傊瑂cRNA-seq揭示了CD7+單核細胞，顯示干細胞樣特性，在體重減輕后在小鼠和人類的BM中積累，這可能在肥胖控制中發(fā)揮作用（圖2）。

圖2 scRNA-seq揭示了減肥后小鼠和人類BM中干細胞樣CD7+單核細胞的積累

Result 3 CD7+單核細胞優(yōu)先遷移到iWAT?

為了進一步確定CD7+單核細胞在肥胖調(diào)節(jié)中的直接作用，從Cyc小鼠中分離出BM來源的CD7+和CD7-單核細胞，并過繼性轉(zhuǎn)移到肥胖前期的WT小鼠中。轉(zhuǎn)染CD7+單核細胞的小鼠體重增加減少，葡萄糖耐量改善，胰島素抵抗減輕，組織重量減輕。CD7+單核細胞受體小鼠的氧消耗和能量消耗增加，而不影響身體活動或呼吸交換比率。移植CD7+單核細胞的小鼠在iWAT中顯示出更高的UCP1和PGC1α表達。免疫組化染色顯示，UCP1染色在iWAT中顯著增強，而在BAT中沒有增強（圖3A-3G）。

為探討CD7+單核細胞是通過駐留在基底細胞中還是通過浸潤脂肪組織發(fā)揮功能。CD7+和CD7-單核細胞在轉(zhuǎn)移前DiR標記，以跟蹤這些細胞在體內(nèi)的運動軌跡。CD7+單核細胞傾向于定位于iWAT，而在BAT中積累較少，在附睪WAT (eWAT)中幾乎沒有積累。與CD7-單核細胞相比，趨化因子受體Gpr183的mRNA和蛋白水平在CD7+單核細胞中升高。CD7+單核細胞中敲除Gpr183，然后用PKH26標記并轉(zhuǎn)移到受體小鼠中。Gpr183敲低CD7+單核細胞轉(zhuǎn)染小鼠iWAT中的PKH26信號遠低于對照CD7+單核細胞轉(zhuǎn)染小鼠，表明Gpr183依賴性CD7+單核細胞優(yōu)先遷移到iWAT（圖3H-3N）。

圖3 CD7+單核細胞優(yōu)先遷移到iWAT

Result 4 誘導(dǎo)CD7+單核細胞耗竭可促進體重恢復(fù)

為了研究CD7+單核細胞在肥胖中的體內(nèi)作用，研究者將R26CAG-LSL-RSR-tdTomato-2A-DTR 小鼠和Lyz2-Cre和 CD7-Dre 小鼠雜交，以實現(xiàn)白喉毒素(DT)給藥后，表達DTR的 CD7+單核細胞的譜系追蹤和基因消融。DT治療CD7-Dre、Lyz2-Cre、R26tdT-DTR小鼠，在不影響B(tài)M免疫細胞組成的情況下，可以高效地消耗BM tdTomato+和相應(yīng)的CD7+單核細胞。與PBS處理的小鼠相比，CD7+單核細胞缺失引起的體重恢復(fù)更快、更強勁，同時脂肪量增加。在高熱量喂養(yǎng)期間，CD7+單核細胞的消耗減少了氧氣消耗和寒冷適應(yīng)能力的受損，卻不影響食物攝入或活動。CD7+單核細胞缺失主要在iWAT中影響UCP1的表達，而在BAT中沒有。綜上所述，這些結(jié)果表明CD7+單核細胞對于控制體重恢復(fù)至關(guān)重要（圖4）。

圖4 誘導(dǎo)CD7+單核細胞耗竭可促進體重恢復(fù)

Result 5 CD7+單核細胞在營養(yǎng)脅迫下進行表觀遺傳適應(yīng)

為了更深入地探索營養(yǎng)波動下CD7+單核細胞的特征，研究者對分離的CD7+單核細胞進行了ATAC-seq。結(jié)果表明，不同喂食模式之間的ATAC-seq peak是不同的。飲食轉(zhuǎn)換引起的ATAC-seq peak變化與肥胖引起的峰值變化在很大程度上呈負相關(guān)。超過14000個peak是由高熱量食物引起的，然后在節(jié)食后消失。這些peak相關(guān)基因在包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的途徑中富集，如Hif1a和Gapdh是BM中缺氧誘導(dǎo)的反應(yīng)和無氧糖酵解至關(guān)重要，并在肥胖時迅速上調(diào)。在肥胖期間獲得而在飲食轉(zhuǎn)換后丟失的peak相關(guān)基因在DNA損傷和修復(fù)途徑和炎癥途徑中富集。在HFD小鼠的CD7+單核細胞中建立了大約800個peak，在Cyc小鼠中進一步保持開放。這些peak相關(guān)基因在脂質(zhì)代謝、細胞遷移以及干細胞維持中富集。整體描繪了CD7+單核細胞在解決炎癥中的生態(tài)位-適應(yīng)平衡（圖5）。

圖5 CD7+單核細胞在營養(yǎng)脅迫下進行表觀遺傳適應(yīng)

Result 6表觀遺傳調(diào)控FGL2介導(dǎo)CD7+單核細胞對米色脂肪產(chǎn)熱的影響

為了進一步描述CD7+單核細胞抵消體重反彈的機制，研究者聯(lián)合分析了在波動營養(yǎng)應(yīng)激期間ATAC-seq與scRNA-seq數(shù)據(jù)。鑒定了5個重疊基因(Fgl2, Tfrc, Dpp4, Nucb2和Serpinb1a)，且與CD7-單核細胞相比，這5個基因在CD7+單核細胞中mRNA水平更高。編碼具有免疫抑制功能的FGL2表達量最高?；蛐徒M織表達(GTEx)數(shù)據(jù)庫分析顯示，人FGL2基因在全血中的表達與CD7+單核細胞的標記轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達呈正相關(guān)。且與Klf4染色質(zhì)可及性增加一致。與CD7-單核細胞培養(yǎng)上清相比，F(xiàn)GL2蛋白水平在CD7+單核細胞培養(yǎng)上清（條件培養(yǎng)基（CM））中高度富集。因此，研究者選擇FGL2進行進一步的研究(圖6A-6D)。

纖維介素蛋白(FGL2)重組蛋白（rFGL2）處理小鼠在iWAT中顯著增強了產(chǎn)熱基因（Ucp1, Ppargc1a, Dio2, Prdm16）和beiging-related基因(Cd137和 Tbx1)的表達。rFGL2處理激活了米色脂肪細胞中的PKA信號通路，而H89處理消除了這一作用，并抑制了UCP1表達上調(diào)。結(jié)果表明，F(xiàn)GL2可能通過促進米色脂肪產(chǎn)熱而促進代謝。Fgl2△Lyz2小鼠（巨噬細胞特異性FGL2敲除小鼠）中分離的CD7+單核細胞的CM顯著抑制了脂肪產(chǎn)熱，補充rFGL2恢復(fù)了UCP1和PGC1a的表達。FGL2顯著削弱了CD7+單核細胞的抗肥胖作用 (圖6E-6G) 。

通過質(zhì)譜分析、qPCR、免疫印跡分析，研究者選擇驗證FGL2是否能與米色脂肪細胞中的TMEM120A結(jié)合。研究者將FLAG-FGL2和HA-TMEM120A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人胚胎腎(HEK) 293T細胞中，收集細胞裂解液進行共免疫沉淀(coIP)實驗，結(jié)果證實FGL2可以與TMEM120A結(jié)合。用TMEM120A siRNA轉(zhuǎn)染米色脂肪細胞，rFGL2處理后，cAMP-PKA信號的激活和下游產(chǎn)熱基因(Ucp1和Ppargc1a)的表達均因TMEM120A缺失而受到抑制。因此證明FGL2結(jié)合TMEM120A促進米色脂肪細胞產(chǎn)熱(圖6H-6M)。

圖6 表觀遺傳調(diào)控FGL2介導(dǎo)CD7+單核細胞對米色脂肪產(chǎn)熱的影響

Result 7 FLT3配體刺激恢復(fù)CD7+單核細胞活力，從而抑制體重反彈

研究者探索了來自Cyc小鼠的BM免疫細胞是否可以在減肥后很長一段時間內(nèi)防止肥胖。小鼠分別飼喂HFD 5周，然后切換為ND喂養(yǎng)3周(Cyc)， 6周(Cyc-6w)或10周(Cyc-10w)。與移植Cyc小鼠BM免疫細胞的小鼠相比，移植Cyc-6w和Cyc-10w小鼠BM免疫細胞的小鼠對肥胖進展和耗氧量的影響很小。Cyc-6w和Cyc-10w小鼠顯示CD7+單核細胞占比降低。Cyc-6w和Cyc-10w小鼠分離的CD7+單核細胞的細胞周期進程被大大抑制，表明CD7+單核細胞在減肥后逐漸進入靜止狀態(tài)（圖7A-7C）。

為了檢測臨床相關(guān)性，研究者招募了一組肥胖志愿者，通過節(jié)食成功減肥(至少10%)。體重減輕后，外周血中hCD7+單核細胞的頻率隨著時間的推移逐漸降低。那些成功維持10%以上體重減輕至少6個月的患者，其hCD7+單核細胞的比例高于體重恢復(fù)的患者。循環(huán)CD7+單核細胞的占比與減肥后6個月的體重恢復(fù)程度呈負相關(guān)。結(jié)果表明，在減肥后很長一段時間內(nèi)喚醒CD7+單核細胞可能有助于對抗體重反彈（圖7D-7F）。

Flt3是一種在造血發(fā)育中起重要作用的BM因子，因此推測Flt3配體(FLT3L)刺激可能使CD7+單核細胞恢復(fù)活力，從而恢復(fù)代謝穩(wěn)態(tài)。首先檢測了BM中FLT3L的水平，發(fā)現(xiàn)其表達在體重減輕后逐漸下降，同時CD7+單核細胞減少，無法控制肥胖。用FLT3L刺激Cyc-10w小鼠2周后，BM和循環(huán)中的CD7+單核細胞均增加。對Cyc、Cyc-10w和FLT3L刺激的Cyc-10w小鼠的CD7+單核細胞進行了ATAC-seq，5,880個peak在靜止期丟失，并在FLT3L刺激下恢復(fù)。恢復(fù)peak相關(guān)基因參與氧化磷酸化(如Ndufa8和Cox5b)和干細胞穩(wěn)態(tài)(如Klf4和Tfdp1)。Klf4和Fgl2轉(zhuǎn)錄起始位點附近的peak也被FLT3L重新激活，進一步證明了FLT3L刺激在再生CD7+單核細胞中的關(guān)鍵作用。FLT3L治療成功地抑制了Cyc-10w小鼠在接受二次HFD喂養(yǎng)時的體重恢復(fù)。FLT3L刺激在Fgl2△Lyz2小鼠中仍然具有一定的肥胖抑制作用。但是在沒有CD7+單核細胞的情況下，F(xiàn)LT3L刺激不再對體重恢復(fù)有抑制作用。這些結(jié)果表明，F(xiàn)LT3L刺激使CD7+單核細胞恢復(fù)活力，從而抑制體重反彈（圖7G-7K）。

圖7 FLT3配體刺激恢復(fù)CD7+單核細胞活力，從而抑制體重反彈

本文研究人員通過對ND、HFD和Cyc組小鼠的BM免疫細胞進行scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)了一種干細胞樣的CD7+單核細胞亞群，它們在節(jié)食引起的體重減輕的小鼠和人類骨髓中聚集。CD7+單核細胞的過繼轉(zhuǎn)移可抑制體重反彈，而CD7+單核細胞的誘導(dǎo)性消耗則會加速體重反彈。這些細胞通過表觀遺傳適應(yīng)積累了新陳代謝記憶，優(yōu)先遷移到皮下白色脂肪組織，并在那里分泌FGL2，激活PKA信號通路，進而促進米色脂肪產(chǎn)熱。CD7+單核細胞在減肥后會逐漸進入靜止狀態(tài)，同時體重增加。值得注意的是，服用FLT3L能顯著恢復(fù)CD7+單核細胞的活力，從而改善體重快速反彈的情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種獨特的骨髓源性代謝記憶免疫細胞群，可以作為防治肥胖癥的靶標。

參考文獻

Zhou HY, Feng X, Wang LW, et al. Bone marrow immune cells respond to fluctuating nutritional stress to constrain weight regain [J]. Cell Metabolism, 2023. DOI: 10.1016/j.cmet.2023.08.009.