細(xì)胞回收率除了與解凍細(xì)胞過程有關(guān)，也與冷凍過程以及使用之抗凍液有很大的關(guān)系。細(xì)胞在冷凍過程中會(huì)遭受許多壓力，包含滲透壓、自由基、休眠代謝等，導(dǎo)致多數(shù)細(xì)胞在冷凍或解凍過程中死亡，敏感的干細(xì)胞更是難以存活。除了這些壓力之外，在操作過程中的細(xì)節(jié)亦可能成為回收率不佳的殺手。在冷凍及解凍的過程中應(yīng)該注意哪些細(xì)節(jié)來增加細(xì)胞的存活率呢?

1. 解凍細(xì)胞時(shí)，為什么細(xì)胞的存活率都不好?

解凍細(xì)胞時(shí)要掌握快速解凍的訣竅，而凍細(xì)胞時(shí)則要掌握緩慢凍結(jié)細(xì)胞之訣竅。解凍細(xì)胞要快是因?yàn)橐乐贡г傩纬啥鴤?xì)胞。存活率不好要先確定解凍細(xì)胞時(shí)之流程是否快狠準(zhǔn)，再來凍細(xì)胞溶液中的 DMSO 會(huì)傷害細(xì)胞，若一開始沒有離心去除，最好在解凍細(xì)胞完后 8-12 小時(shí)(若為貼附細(xì)胞，要先確定細(xì)胞已貼盤)再次更換新鮮培養(yǎng)液。除此之外也有可能是凍細(xì)胞時(shí)操作不當(dāng)造成細(xì)胞在凍細(xì)胞時(shí)就已死亡。

2. 解凍細(xì)胞存活率不好，若是凍細(xì)胞時(shí)的問題?

凍細(xì)胞前要先確定細(xì)胞處在生長旺盛的 log phase，且需先檢測細(xì)胞是否還保持其性質(zhì)，例如，是否還有抗體或蛋白質(zhì)產(chǎn)生，凍細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞濃度要在 1~5 x 10^6。再來是抗凍液之比例，DMSO約為 5-10%，其他種抗凍液則依照說明書使用。抗凍液主要用途是放慢冰晶產(chǎn)生之速度，避免冰晶刺破細(xì)胞膜，傷害細(xì)胞。凍細(xì)胞時(shí)需緩慢降溫也是要避免冰晶快速產(chǎn)生造成細(xì)胞傷害，而在 4 度到-20 度這個(gè)過程建議不要超過 1 小時(shí)，以防止冰晶過大，傷害細(xì)胞。

3. 為什么使用 Trypsin 有些細(xì)胞很快就下來，有些無法打下來?

每株細(xì)胞特性皆不相同，無法使用單一 protocol 處理。第一次使用 trypsin 時(shí)，最好觀察此株細(xì)胞對 trypsin 的耐受程度，若細(xì)胞很快就被切斷 ECM 鍵結(jié)，則之后加入 Trypsin 后可在室溫作用，避免在 37 度中作用對細(xì)胞造成傷害。若細(xì)胞打不下來，則可以放置 37 度作用約 5 分鐘，不要放太久，避免傷害細(xì)胞。除此之外要注意的是，在加入 trypsin 之前是否有使用不含鈣鎂離子的?PBS?或DPBS 將舊的培養(yǎng)液清洗干凈，因舊的培養(yǎng)液中會(huì)中和 Trypsin 之作用，鈣鎂離子也會(huì)與 Trypsin 結(jié)合，造成 Trypsin 無法作用。

細(xì)胞培養(yǎng)真的是一個(gè)非常注重細(xì)節(jié)的實(shí)驗(yàn)，每一個(gè)小細(xì)節(jié)都有可能對細(xì)胞造成不可抹滅的影響，且不同細(xì)胞株有不同特性，需要注意的細(xì)節(jié)會(huì)不太一樣，除了自己尋找文獻(xiàn)了解細(xì)胞特性外，也可以依賴實(shí)驗(yàn)室學(xué)長姊的經(jīng)驗(yàn)分享及傳承喔！