細胞計數(shù)實驗

繼上次我們推出初學(xué)者實驗教程系列之后，很多站友發(fā)來私信，希望我們分享更多實驗有關(guān)的內(nèi)容。請大家繼續(xù)關(guān)注我們的獻給初學(xué)者欄目，會有更多大家常用的實驗教程和大家見面。

今天我們就來聊一聊細胞計數(shù)實驗。

實驗用品?

0.4% 臺盼藍溶液、無水乙醇或 95% 乙醇溶液、脫脂棉、普通顯微鏡、試管、吸管、毛細吸管、細胞計數(shù)板、綢布。

實驗原理

在細胞培養(yǎng)工作中，常需要了解細胞生活狀態(tài)和鑒別細胞死活，確定細胞接種濃度和數(shù)量以及了解細胞存活率和增殖度，如用酶消化制備的細胞懸液中細胞活力的鑒別，凍存細胞復(fù)蘇后的活力檢測等。

細胞懸液制備后，常用活體染料臺盼藍對細胞進行染色，進行細胞計數(shù)。臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞內(nèi)而使細胞著色（藍色）。

細胞計數(shù)一般用血細胞計數(shù)板，按白細胞計數(shù)方法進行計數(shù)，便于確定細胞的生活狀況。

實驗內(nèi)容與方法

1. 制備動物細胞懸液

將動物細胞用生物鹽水制備成適當濃度的細胞懸液備用。

2. 細胞計數(shù)?

（1）計數(shù)板處理

用無水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭計數(shù)板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計數(shù)板上面。

（2）染色

用滴管吸取 0.4% 臺盼藍染液，按 1∶1 比例加入細胞懸液中。從計數(shù)板邊緣緩緩滴入，使之充滿計數(shù)板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計數(shù)板放在低倍鏡下（10×10 倍）觀察計數(shù)。

（3）計數(shù)方法

按圖計算計數(shù)板的四角大方格（每個大方格又分 16 個小方格）內(nèi)的細胞數(shù)。計數(shù)時，只計數(shù)完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計下線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。二次重復(fù)計數(shù)誤差不應(yīng)超過 ±5%（圖 7-1）。鏡下觀察，凡折光性強而不著色者為活細胞，染上藍色者為死細胞。

（4）計數(shù)的換算

計完數(shù)后，需換算出每 ml 懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為 0.01 cm2，高為 0.01 cm，這樣它的體積為 0.0001 cm3，即 0.1 mm3。由于 1 ml = 1 000 mm3，所以每一大方格內(nèi)細胞數(shù)×10 000 = 細胞數(shù) /ml，故可按下式計算：

細胞懸液細胞數(shù) /mL = 4 個大格細胞總數(shù) /4×10 000。

如計數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。

計數(shù)細胞后，計算細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數(shù)的比例。

注意事項

向計數(shù)板中滴細胞懸液時要干凈利落，加量要適當，過多易使蓋片漂移，或淹過蓋片則失敗，需重做，過少易出現(xiàn)氣泡。不理想時，應(yīng)重做。

鏡下計數(shù)時，若方格中細胞分布明顯不均，說明細胞懸液混合不均勻，需重新將細胞懸液進行混合，再重新計數(shù)。