最近CRISPR文庫火“出圈”了，小源在這里整理了一份CRISPR文庫速記攻略，幫助你快速了解CRISPR文庫！攻略主要包括以下幾個(gè)部分：

1.?CRISPR文庫簡(jiǎn)介

2.?CRISPR文庫有哪些應(yīng)用？

2.1篩選癌癥治療相關(guān)靶點(diǎn)

2.1.1識(shí)別腫瘤驅(qū)動(dòng)基因

2.1.2篩選合成致死基因?qū)?/span>

2.1.3篩選腫瘤耐藥基因

2.2篩選病毒感染相關(guān)的宿主因子

2.3其他（信號(hào)通路、抗體靶標(biāo)）

3.?CRISPR文庫分類以及如何選擇？

3.1篩選范圍（全基因組/亞文庫，現(xiàn)貨/定制）

3.2篩選要求（功能缺失/功能獲得/單細(xì)胞測(cè)序/點(diǎn)突變文庫）

3.3篩選目的（陽性篩選/陰性篩選）

4.?CRISPR文庫如何構(gòu)建與篩選？

CRISPR文庫簡(jiǎn)介

CRISPR文庫是基于CRISPR/Cas9技術(shù)建立的高通量基因篩選方案。通過高通量合成sgRNA構(gòu)建質(zhì)粒文庫，包裝為慢病毒后以低MOI（通常＜0.3）感染待篩選細(xì)胞，確保一個(gè)細(xì)胞只進(jìn)入一種sgRNA，再給細(xì)胞加以篩選因素（如藥物處理、低氧處理、病毒感染或細(xì)胞本身的生存能力等），收集篩選后的細(xì)胞進(jìn)行NGS測(cè)序，分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間sgRNA的富集或耗竭情況，獲得與篩選因素相關(guān)的宿主因子。

相比cDNA文庫與RNAi文庫，CRISPR/Cas9具有多功能性、低噪聲、高敲除效率和較小的脫靶效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，是大規(guī)?；蚬δ芎Y選的首選平臺(tái)。

CRISPR文庫有哪些應(yīng)用？

1.?癌癥治療

1）識(shí)別腫瘤必需基因，針對(duì)致癌基因進(jìn)行靶向治療。

惡性腫瘤累積了很多基因突變，但這些腫瘤細(xì)胞維持惡性表型通常只依賴其中某個(gè)/某些突變活化的癌基因，這種現(xiàn)象叫癌基因成癮（oncogene addiction），這些癌基因也稱為驅(qū)動(dòng)癌基因（driver oncogenes）。阻斷這些驅(qū)動(dòng)基因的活性可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生快速調(diào)亡、生長(zhǎng)阻滯或分化，而對(duì)正常細(xì)胞影響較小，這種差異化為腫瘤的靶向治療帶來了希望。

近年來二代測(cè)序的廣泛應(yīng)用已經(jīng)找出很多腫瘤細(xì)胞存在的突變點(diǎn)，但是無法很好的區(qū)分哪些是驅(qū)動(dòng)突變。通過基因失活找出腫瘤細(xì)胞生存依賴的驅(qū)動(dòng)基因是個(gè)更簡(jiǎn)單直接的方法。CRISPR文庫可以同時(shí)靶向全基因組不同基因，是實(shí)現(xiàn)高通量基因失活的絕佳工具。2014年，Shalem等[1]首次利用GeCKO文庫鑒定出人黑色素瘤細(xì)胞和多能干細(xì)胞存活的關(guān)鍵基因（圖1）。Wang等[2]利用CRISPR全基因組文庫篩選將NCAPG鑒定為肝細(xì)胞癌腫瘤生長(zhǎng)的必須癌基因。Kiessling等[3]利用CRISPR全基因組文庫篩選驗(yàn)證了HCC-827細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)基因EGFR和CHP-212細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)基因NRAS和MEK1，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了新的驅(qū)動(dòng)基因TBK1和TRIB2并用于進(jìn)一步研究。

2）篩選合成致死作用靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。

針對(duì)致癌基因可以使用抑制劑進(jìn)行靶向治療，而對(duì)于抑癌基因而言，其功能的失活導(dǎo)致無法直接靶向，通常采用靶向與失活的抑癌基因具有合成致死作用的基因搭檔。合成致死（Synthetic lethality）指兩個(gè)非致死基因同時(shí)失活導(dǎo)致細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。假如腫瘤細(xì)胞中存在特定基因A失活，那么用藥物抑制它的合成致死搭檔基因B，使兩者都失活，而健康的體細(xì)胞因?yàn)橛姓５幕駻，能夠保證正常的生理功能的表達(dá)，不會(huì)受到藥物的傷害，從而只特異性的殺死該類腫瘤細(xì)胞（如圖2）[4]。

合成致死最典型的應(yīng)用就是PARP抑制劑治療BRCA1/2突變的腫瘤，截止2020年，PARP抑制劑全球銷售額已經(jīng)超過20億美元！那么如何尋找更多具有合成致死作用的基因?qū)δ?？CRISPR文庫高通量篩選起了大作用！CRISPR文庫篩選合成致死作用一般有兩種邏輯，一種是直接設(shè)計(jì)雙重打靶的gRNA載體，即在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)靶向兩個(gè)基因，篩選具有合成致死作用的基因?qū)Γ?Shen等[5]采用這種方法對(duì)3種實(shí)驗(yàn)癌細(xì)胞系（Hela、A549和293T）中的73個(gè)基因進(jìn)行了150000個(gè)組合的篩選，找出120種有合成致死作用的基因?qū)Γㄈ鐖D3）。另外一種邏輯就是在單個(gè)抑癌基因敲除的細(xì)胞系上進(jìn)行文庫篩選，篩出與敲除的抑癌基因具有合成致死作用的靶點(diǎn)，F(xiàn)eng等[6]就是采用這種方法先在293A細(xì)胞上構(gòu)建了12個(gè)已知抑癌基因敲除細(xì)胞系，再用全基因組敲除文庫對(duì)野生型和敲除細(xì)胞系進(jìn)行CRISPR篩選，分析同一細(xì)胞篩選前后gRNA的豐度變化，通過對(duì)比野生型和抑癌基因敲除細(xì)胞系在CRISPR篩選后gRNA的豐度差異確定潛在的合成致死基因。

3）尋找腫瘤耐藥相關(guān)基因，研究耐藥機(jī)制，優(yōu)化治療方案。

腫瘤分子靶向藥物面臨的主要問題是耐藥，因此探討靶向藥物的耐藥機(jī)制有著重要的臨床意義。經(jīng)CRISPR文庫正向篩選，絕大部分細(xì)胞因?qū)λ幬锩舾卸劳觯糠旨?xì)胞由于發(fā)生特定基因敲除產(chǎn)生抗藥性而存活了下來。通過檢測(cè)存活細(xì)胞攜帶的gRNA可以將與耐藥性產(chǎn)生相關(guān)的基因篩選出來。

Vemurafenib被批準(zhǔn)用于攜帶BRAFV600E?突變的晚期黑色素瘤的治療。為了研究Vemurafenib的耐藥機(jī)制，Shalem等[1]設(shè)計(jì)了包含64751條sgRNA、靶向全基因組18080個(gè)基因的敲除文庫，經(jīng)過細(xì)胞感染，加藥富集，最終篩選出nf1、med12、nf2、cul3、tada2b和tada1等耐藥相關(guān)基因，并提出了新的Vemurafenib腫瘤耐藥機(jī)制假說。

2.?篩選病毒感染相關(guān)的宿主因子

CRISPR文庫篩選還常用于研究病毒感染相關(guān)的宿主因子。針對(duì)丙肝病毒、登革病毒、日本腦炎病毒和西尼羅病毒,目前已經(jīng)篩選出了一批與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能以及受體相關(guān)的宿主因子。如，Zhang等人[7]通過CRISPR/Cas9?的全基因組篩選驗(yàn)證了黃病毒感染所需的九個(gè)人類基因，這些基因都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?(ER)?功能（包括易位、蛋白質(zhì)降解和?N-連接糖基化）相關(guān)。Ma等人[8]通過設(shè)計(jì)包含77,406個(gè)sgRNAs、針對(duì)20,121個(gè)基因的文庫，對(duì)全基因組進(jìn)行篩選，得出EMC2、EMC3、SEL1L等7個(gè)附屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解通路（ERAD）的基因。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，敲除這些基因后不會(huì)阻止西尼羅病毒（WNV）的復(fù)制，但會(huì)阻止該病毒致死細(xì)胞。

3.?信號(hào)通路、抗體靶標(biāo)等

除了腫瘤相關(guān)基因篩選和病毒感染宿主因子篩選，CRISPR文庫篩選還在抗體靶標(biāo)篩選、細(xì)胞信號(hào)通路研究、非編碼基因功能研究等方面有著廣泛的應(yīng)用。

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文庫分類以及如何選擇？

文庫的類型很多，如果不夠了解，可能就選擇困難了。下面我們就從三個(gè)分類維度來教大家如何區(qū)分文庫類型以及如何選擇合適的文庫：

1.?篩選范圍（全基因組/亞文庫？）

從文庫大小可以分為全基因組文庫和亞文庫，全基因組文庫通常是針對(duì)某一物種所有編碼基因設(shè)計(jì)打靶g(shù)RNA，覆蓋面大，但與此同時(shí)其篩選工作量也將很龐大。亞文庫或子文庫指某一類基因的組合，比如某個(gè)基因家族、某個(gè)信號(hào)通路等。目前已構(gòu)建好的現(xiàn)貨文庫有很多，如人/小鼠/綠猴的全基因組文庫，激酶、核蛋白、細(xì)胞周期蛋白、代謝相關(guān)蛋白和表觀遺傳相關(guān)蛋白亞文庫等。一般要根據(jù)具體需求選擇文庫范圍，其次優(yōu)先選擇有現(xiàn)貨的文庫，最后選擇能滿足篩選要求的最小文庫，盡可能減小后續(xù)的篩選工作量。

源井可提供人/小鼠全基因組文庫，激酶、核蛋白、細(xì)胞周期蛋白、代謝相關(guān)蛋白和表觀遺傳相關(guān)蛋白亞文庫等CRISPR現(xiàn)貨文庫，覆蓋度>99%，均一性<10，可復(fù)制鏈接了解詳情>>https://www.ubigene.com/service/crispr/3108.html

2.?篩選要求（功能缺失/功能獲得/其他？）

????確定了篩選范圍，就要考慮篩選要求了，明確研究目的是需要進(jìn)行功能缺失型（Loss-of-function）篩選，還是功能獲得型（Gain-of-function）篩選？前者一般選擇CRISPR-KO或CRISPRi系統(tǒng)進(jìn)行構(gòu)建，一般來說CRISPR-KO的敲除效果更好，但是對(duì)于細(xì)胞必需基因（敲除后致死）或者非編碼基因（不編碼蛋白，無法造成移碼）而言，CRISPRi系統(tǒng)是個(gè)更好的選擇。CRISPRi系統(tǒng)是將催化失活的dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制因子組成融合蛋白，與靶向基因上游調(diào)控區(qū)域的gRNA共轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)基因敲降。如若需要進(jìn)行功能獲得型篩選則選擇CRISPRa系統(tǒng)，CRISPRa系統(tǒng)是通過將催化失活的dCas9與轉(zhuǎn)錄激活因子連接，靶向基因上游調(diào)控區(qū)域增強(qiáng)基因表達(dá)。

其他要求：1）Barcode文庫：傳統(tǒng)的CRISPR pool篩選一般要求是與細(xì)胞增殖/存活相關(guān)的表型，這樣有利于特定細(xì)胞的富集。但如果是不明顯的表型，如新陳代謝、組織穩(wěn)態(tài)等，則需要借助單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。在這種情況下，構(gòu)建文庫時(shí)還可能需要改造CRISPR骨架，增加相應(yīng)的barcode序列。2）Base editing文庫：利用Base editing的方法（CBE、ABE等）構(gòu)建針對(duì)某個(gè)基因或某些基因的單堿基突變（SNVs）文庫。

3.篩選目的（陽性篩選/陰性篩選？）

根據(jù)篩選目的的不同，可以分為陽性篩選和陰性篩選（也叫正向篩選和負(fù)向篩選）。陽性篩選是對(duì)已成功整合sgRNA的細(xì)胞文庫施加一定的篩選壓力，僅使少數(shù)目的表型的細(xì)胞能夠存活，達(dá)到富集關(guān)鍵基因的目的。陰性篩選則與之相反，存活的細(xì)胞并不是目的表型細(xì)胞，需要比較不同時(shí)間點(diǎn)sgRNA的豐度找出差異sgRNA才能確定關(guān)鍵基因，但陰性篩選可以鑒定出引起細(xì)胞某些功能缺失的基因。如果拉長(zhǎng)篩選時(shí)間，還可以篩選到細(xì)胞生存所必需的基因。前面提到的應(yīng)用案例中，篩選驅(qū)動(dòng)基因和合成致死基因?qū)儆陉幮院Y選，而篩選耐藥性基因和病毒感染所需的宿主因子則屬于陽性篩選。

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文庫如何構(gòu)建與篩選？

1.?文庫構(gòu)建：針對(duì)某個(gè)物種，每個(gè)基因設(shè)計(jì)3-6條sgRNA，采用高通量芯片合成sgRNA，再將合成的sgRNA通過Gibson組裝克隆到慢病毒載體中。

2.?病毒包裝與轉(zhuǎn)導(dǎo)：將質(zhì)粒文庫包裝成慢病毒，并以低MOI（一般標(biāo)準(zhǔn)<0.3）感染靶細(xì)胞，保證一個(gè)病毒顆粒感染一個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞文庫中包含的細(xì)胞的數(shù)量一般為全部sgRNA數(shù)量的200-1000倍。

3.?細(xì)胞篩選：將全基因組敲除細(xì)胞庫分成兩份，其中一份作為實(shí)驗(yàn)組施加篩選壓力，如：病毒侵染，藥物治療等；另一份作為對(duì)照組。根據(jù)耐藥性、增殖能力、存活能力等表型篩選細(xì)胞。

4.?NGS測(cè)序與數(shù)據(jù)分析：將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分別抽提基因組，PCR擴(kuò)增sgRNA片段，進(jìn)行NGS測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

5.?基因功能驗(yàn)證：通過CRISPR/Cas9敲除單個(gè)候選基因，或進(jìn)行過表達(dá)/回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。

源井CRISPR文庫服務(wù)亮點(diǎn)：

①紅棉CRISPR基因編輯系統(tǒng)：高通量自動(dòng)化設(shè)計(jì)gRNA，確保gRNA特異性和切割效率。

②確保高轉(zhuǎn)化效率：使用自主研發(fā)的超級(jí)感受態(tài)，并采用電轉(zhuǎn)的方式提高轉(zhuǎn)化效率，嚴(yán)格把控長(zhǎng)菌數(shù)量≥500X，確保轉(zhuǎn)化效率。保證文庫覆蓋度＞99%和均一性＜10。

③豐富的慢病毒包裝經(jīng)驗(yàn)：確保病毒滴度和純度及混合質(zhì)粒病毒包裝過程的均一性。

④近100種Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株現(xiàn)貨：省去Cas9病毒感染環(huán)節(jié)，文庫篩選周期縮短3-5周。

⑤經(jīng)驗(yàn)豐富平臺(tái)完善：豐富的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)和完善的下游表型分析平臺(tái)，可以提供多種細(xì)胞篩選服務(wù)。

⑥CRISPR-UTM細(xì)胞基因編輯平臺(tái)：已在超200種細(xì)胞上積累5000+成功案例，提供基因功能驗(yàn)證服務(wù)，保證交付KO純合克隆。

源井生物擁有上述全基因組（人/鼠）、激酶、核蛋白、代謝基因等8大CRISPR現(xiàn)貨文庫，同時(shí)提供從質(zhì)粒文庫構(gòu)建、病毒包裝、到細(xì)胞篩選和NGS測(cè)序分析等全流程服務(wù)，更有CRISPR-KO、CRISPRi、CRISPRa三大類文庫系統(tǒng)可選，滿足不同需求?？蓮?fù)制鏈接了解詳情>>https://www.ubigene.com/service/crispr/3108.html

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文獻(xiàn)參考

[1]?Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelson T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-87. doi: 10.1126/science.1247005. Epub 2013 Dec 12. PMID: 24336571; PMCID: PMC4089965.

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[3]?Kiessling M K, Schuierer S, Stertz S, et al. Identification of oncogenic driver mutations by genome-wide CRISPR-Cas9 dropout screening[J]. BMC genomics, 2016, 17(1): 1-16.

[4]?Sasaki M, Ogiwara H. Synthetic lethal therapy based on targeting the vulnerability of SWI/SNF chromatin remodeling complex‐deficient cancers[J]. Cancer Science, 2020, 111(3): 774-782.

[5]?Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, Bojorquez-Gomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN, Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, Ideker T, Mali P. Combinatorial CRISPR-Cas9 screens for de novo mapping of genetic interactions. Nat Methods. 2017 Jun;14(6):573-576. doi: 10.1038/nmeth.4225. Epub 2017 Mar 20. PMID: 28319113; PMCID: PMC5449203.

[6]?Feng X, Tang M, Dede M, et al. Genome-wide CRISPR screens using isogenic cells reveal vulnerabilities conferred by loss of tumor suppressors[J]. Science advances, 2022, 8(19): eabm6638.

[7]?Zhang R, Miner JJ, Gorman MJ, Rausch K, Ramage H, White JP, Zuiani A, Zhang P, Fernandez E, Zhang Q, Dowd KA, Pierson TC, Cherry S, Diamond MS. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 2016 Jul 7;535(7610):164-8. doi: 10.1038/nature18625. Epub 2016 Jun 17. PMID: 27383988; PMCID: PMC4945490.

[8]?Ma H, Dang Y, Wu Y, Jia G, Anaya E, Zhang J, Abraham S, Choi JG, Shi G, Qi L, Manjunath N, Wu H. A CRISPR-Based Screen Identifies Genes Essential for West-Nile-Virus-Induced Cell Death. Cell Rep. 2015 Jul 28;12(4):673-83. doi: 10.1016/j.celrep.2015.06.049. Epub 2015 Jul 16. PMID: 26190106; PMCID: PMC4559080.