擦臺(tái)子（先擦自己面前的）?+擦槍

操作基礎(chǔ)常識(shí)：

吹散細(xì)胞：就是用槍吸打吸打

粗準(zhǔn)焦螺旋調(diào)節(jié)：對(duì)準(zhǔn)到不同層的細(xì)胞

不同孔板的量：12孔板裝2mL或1mL培養(yǎng)基；96孔板裝100微升培養(yǎng)基。

不同培養(yǎng)皿的量：小培養(yǎng)瓶要4-5mL培養(yǎng)基；培養(yǎng)皿要6,7,8ml培養(yǎng)基（大皿相當(dāng)于三四個(gè)小瓶）

胰酶用量：小瓶1ml胰酶，大瓶2mL胰酶消化

①培養(yǎng)基配制：

1）10ml胰酶消化液=1ml胰酶+0.5mlEDTA+8.5mlPBS

實(shí)際操作：用濾膜過濾后的EDTA（2mL），胰酶(4mL)各拿一管配到40mL

2）10％的胎牛血清+1％的雙抗（青霉素和鏈霉素）

eg.50mL細(xì)胞培養(yǎng)基：

5mL血清+500微升雙抗+拿培養(yǎng)基加到五十毫升即可

②復(fù)蘇：

1）巨噬細(xì)胞-DMEM培養(yǎng)基

去掉細(xì)胞凍存液：凍存液一管是1mL，加DMEM后1mL變成2mL再離心，巨噬細(xì)胞離心1000轉(zhuǎn)3min?？梢灾苯与x心完從細(xì)胞的那面倒掉。

③鋪板：

晃動(dòng)培養(yǎng)器皿前后各十次混勻

1）巨噬細(xì)胞：不用胰酶消化，直接吹打。不要老是對(duì)著一個(gè)地方吹，掃吹。

2）B16F10黑色素瘤細(xì)胞：在瓶中的要1mL胰酶消化用1mL培養(yǎng)基中和后鋪板（事先可以1mL胰酶/PBS洗一下，晃一下就可以），在顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，有點(diǎn)小空隙（但不能飄），大概半分鐘的樣子（根據(jù)實(shí)際情況摸索）。

④換液：培養(yǎng)皿變黃時(shí)換液。

△倒掉液體的時(shí)候一定要把皿邊上殘留的液體用酒精棉擦干凈，否則接縫處易染菌。

△槍頭不要對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞，對(duì)準(zhǔn)培養(yǎng)皿的壁加，防止沖下細(xì)胞。因?yàn)榫奘杉?xì)胞容易被沖散。

⑤加細(xì)胞因子：細(xì)胞因子50ng/mL

把細(xì)胞因子IL-4和LPS加到培養(yǎng)基里再給細(xì)胞加。

?PS：50ug的粉末（3000元）

⑥MTT：MTT?0.5mg/mL

96孔板 （N=5）100微升血清?

△記得槍不要對(duì)著細(xì)胞，貼著孔壁吸取液體。

eg. 三分之一瓶細(xì)胞鋪一塊96孔板（5*8左右，中間一小塊）

⑦極化巨噬細(xì)胞：12孔板?（N=3）?孵育24h

《流式之前的染色》

在板里吸掉培養(yǎng)基后加PBS吹打再離心去掉PBS

1微升抗體+100微升PBS （是含0.1%BSA的PBS）加到細(xì)胞里孵育10-15min，洗兩遍。

加100微升多聚甲醛泡15-20mn離心掉

擴(kuò)展：骨髓原代細(xì)胞提取出來之后用集落刺激因子刺激后才分化成DC細(xì)胞（此時(shí)可能會(huì)有團(tuán)聚現(xiàn)象）