膀胱癌（BCa）是尿路最常見的尿路上皮癌之一，發(fā)病率和死亡率都很高，占全球所有癌癥的3.2%。膀胱癌轉(zhuǎn)移患者的困境是由于早期難以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移和缺乏有效的靶向治療藥物。而Wnt信號(hào)通路是一個(gè)典型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是癌癥進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子，Wnt5a的異常表達(dá)可持續(xù)激活Wnt信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移，可為BCa的治療提供一個(gè)有效的靶點(diǎn)。特別值得關(guān)注的是，前體mRNA經(jīng)反向剪接形成的環(huán)狀RNA（circRNA）在BCa中廣泛表達(dá)，影響其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，環(huán)狀RNA生物發(fā)生介導(dǎo)BCa遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不清楚。

2023年8月2日，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院泌尿外科陳長昊教授、林天歆教授及黃健教授研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.3）發(fā)表文章【ZEB1-mediated biogenesis of circNIPBL sustains the metastasis of bladder cancer via Wnt/β-catenin pathway】。作者發(fā)現(xiàn)circNIPBL激活Wnt5a/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，通過海綿吸附miR-16-2-3p使ZEB1的表達(dá)水平上調(diào)。此外，ZEB1與NIPBL前體mRNA的側(cè)翼內(nèi)含子1 45999-46005nt和內(nèi)含子9 618-624nt結(jié)合使其反向剪接，促進(jìn)circNIPBL的生物發(fā)生，最終形成一個(gè)正反饋回路，促進(jìn)BCa的轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1介導(dǎo)的circNIPBL生物發(fā)生形成ZEB1/circNIPBL/Wnt5a正反饋回路調(diào)節(jié)BCa轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，揭示circNIPBL可能是BCa的有效治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。

circNIPBL與膀胱癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)

為了探索與BCa轉(zhuǎn)移相關(guān)的環(huán)狀RNA，作者通過高通量測序發(fā)現(xiàn)了5個(gè)顯著上調(diào)的環(huán)狀RNA，進(jìn)一步評估發(fā)現(xiàn)circNIPBL（hsa_circ_0001472）在BCa組織中上調(diào)最顯著。KaplanMeier和FISH分析結(jié)果顯示，circNIPBL顯著上調(diào)，并導(dǎo)致了BCa患者的低生存率。

接著，作者通過Sanger測序和PCR分析驗(yàn)證了circNIPBL的反向剪接結(jié)構(gòu)，證明circNIPBL通過頭尾剪接而不是基因組重排形成的。通過RNase R和放線菌素D實(shí)驗(yàn)表明，circNIPBL結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有更長的半衰期。綜上所述，circNIPBL是一個(gè)具有穩(wěn)定共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA。

circNIPBL增強(qiáng)BCa的遷移和侵襲

為了評估circNIPBL的功能，作者首先研究了circNIPBL在體外是否能促進(jìn)BCa細(xì)胞轉(zhuǎn)移。qRT-PCR分析顯示，circNIPBL在UM-UC-3和T24細(xì)胞中過表達(dá)。傷口愈合試驗(yàn)顯示，過表達(dá)circNIPBL促進(jìn)了BCa細(xì)胞的遷移，而沉默circNIPBL顯著抑制了BCa細(xì)胞的遷移，Transwell檢測同樣證明過表達(dá)circNIPBL也能增強(qiáng)了BCa細(xì)胞的侵襲和遷移能力。這些結(jié)果表明，過表達(dá)circNIPBL可增強(qiáng)了BCa細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

接著，作者進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估了circNIPBL在BCa轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用。使用熒光素酶標(biāo)記的circNIPBL過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BCa細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)circNIPBL促進(jìn)了BCa細(xì)胞發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移數(shù)量評估和IHC結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。以上結(jié)果表明，circNIPBL可促進(jìn)體內(nèi)BCa發(fā)生轉(zhuǎn)移。

CircNIPBL與miR-16-2-3p直接結(jié)合

作者研究了circNIPBL促進(jìn)BCa轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。通過核質(zhì)分級(jí)分析和FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了circNIPBL存在于BCa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。運(yùn)用RNA pulldown探針法發(fā)現(xiàn)BCa細(xì)胞中只有miR-16-2-3p被circNIPBL富集。作者再用FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circNIPBL和miR-16-2-3p共定位于BCa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中?？傊?，circNIPBL直接與miR-16-2-3p結(jié)合。

接下來，作者進(jìn)一步研究了circNIPBL的海綿吸附作用。傷口愈合測定和transwell測定表明，miR-16-2-3p過表達(dá)抑制了BCa細(xì)胞的遷移和侵襲，而miR16-2-3p敲低顯示出相反的效果。此外，circNIPBL過表達(dá)顯著抑制了miR-16-2-3p的作用?？傊?，circNIPBL通過充當(dāng)miR-16-2-3p的海綿來促進(jìn)BCa細(xì)胞的遷移和侵襲。

circNIPBL通過靶向miR-16-2-3p使Wnt5a上調(diào)

作者通過TargetScan、Pictar和miRDB分析并預(yù)測了miR-16-2-3p的下游靶基因，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路是最顯著富集的通路。而且，Wnt5a 3'UTR具有miR-16-2-3p的互補(bǔ)序列，進(jìn)一步確定了Wnt5a是miR-16-2-3p的下游靶標(biāo)，并通過熒光素酶檢測證實(shí)了其互作關(guān)系。

另外，作者發(fā)現(xiàn)circNIPBL表達(dá)下調(diào)后Wnt5a的表達(dá)減少，而在circNIPBL表達(dá)上調(diào)時(shí)Wnt5a表達(dá)增加。此外，WB也表明miR-16-2-3p模擬物抑制了Wnt5a在BCa細(xì)胞中的表達(dá)。總之，這些結(jié)果表明circNIPBL作為miR-16-2-3p海綿而激活Wnt5a的表達(dá)。

circNIPBL通過激活BCa中的wnt信號(hào)通路使ZEB1的表達(dá)上調(diào)

作者在BCa細(xì)胞中過表達(dá)circNIPBL，WB結(jié)果表明Wnt5a和β-catenin的表達(dá)上調(diào)。而下調(diào)circNIPBL明顯抑制BCa細(xì)胞中Wnt5a和β-catenin的表達(dá)，表明circNIPBL使Wnt5a的表達(dá)上調(diào)以激活BCa中的Wnt/β-catenin途徑。

Wnt信號(hào)通路與上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)。因此，作者通過qRT-PCR分析研究了EMT關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在BCa細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZEB1在過表達(dá)circNIPBL后上調(diào)。此外，WB和qRT-PCR結(jié)果顯示，ZEB1的蛋白質(zhì)和mRNA水平與miR-16-2-3p呈負(fù)相關(guān)，表明circNIPBL通過吸附miR-16-2-3p和激活Wnt信號(hào)通路使ZEB1上調(diào)。

此外，WB和IF分析證實(shí)，過表達(dá)circNIPBL使間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin的表達(dá)上調(diào)但抑制了上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)，而敲低circNIPBL具有相反的作用?？傊?，這些結(jié)果表明circNIPBL通過激活Wnt信號(hào)通路使ZEB1的表達(dá)上調(diào)并誘導(dǎo)BCa發(fā)生EMT。

ZEB1與NIPBL前體RNA的側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合以觸發(fā)circNIPBL生物發(fā)生

IHC和RNA FISH分析顯示，ZEB1的表達(dá)與circNIPBL呈正相關(guān)，這表明ZEB1促進(jìn)circNIPBL的生物發(fā)生。作者構(gòu)建了一個(gè)雙色熒光報(bào)告元件來同時(shí)量化線性RNA和環(huán)狀RNA的剪接表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BCa細(xì)胞中過表達(dá)ZEB1后，circNIPBL表達(dá)水平上調(diào)。

作者通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測到NIPBL前體mRNA外顯子（2–9）的側(cè)翼內(nèi)含子有潛在結(jié)合位點(diǎn)。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZEB1顯著富集了NIPBL前體mRNA的側(cè)翼內(nèi)含子，而突變該結(jié)合位點(diǎn)會(huì)顯著降低ZEB1對側(cè)翼內(nèi)含子的富集，綜上表明，ZEB1與NIPBL前體RNA的側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合以觸發(fā)circNIPBL生物發(fā)生。

circNIPBL介導(dǎo)的正反饋回路在BCa患者中的臨床相關(guān)性

為了探討miR-16-2-3p和Wnt5a在BCa患者中的臨床意義，作者通過qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)miR-16-2-3p的表達(dá)與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，而Wnt5a的表達(dá)與BCa的病理分級(jí)呈正相關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示，miR-16-2-3p過表達(dá)的BCa患者的OS和DFS更長。RNA FISH分析結(jié)果顯示，N-cadherin與circNIPBL表達(dá)呈正相關(guān)，而E-cadherin與circNIPBL表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明circNIPBL介導(dǎo)的miR-16-2-3p/Wnt5a正反饋回路促進(jìn)了BCa的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

總結(jié)

本文揭示了circNIPBL作為miR16-2-3p的海綿而激活Wnt信號(hào)通路的新機(jī)制，該機(jī)制使ZEB1的表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)了NIPBL mRNA的反向剪接以形成正反饋回路。本研究為ZEB1介導(dǎo)的circNIPBL生物發(fā)生的重要作用以及ZEB1/ circNIPBL/Wnt5a正反饋回路在BCa遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的獨(dú)特機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)，提示circNIPBL是BCa患者的創(chuàng)新治療靶點(diǎn)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s13046-023-02757-3