寫在前面

????????今天推薦的是由美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)教堂山分校在2019年3月20日發(fā)表于Cell Reports（2020IF：9.423，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Michael J. Emanuele教授，研究表明FOXM1被USP21去泛素化可以調(diào)節(jié)基底樣乳腺癌的細(xì)胞周期進(jìn)程和紫杉醇敏感性。

研究背景

????????轉(zhuǎn)錄因子FOXM1有助于細(xì)胞周期進(jìn)程，并在基底樣乳腺癌(BLBC)中顯著上調(diào)。盡管它在正常和癌細(xì)胞周期中很重要，但現(xiàn)今對(duì)調(diào)節(jié)FOXM1的機(jī)制缺乏完整的了解。

摘要部分

????????作者在基于RNAi的篩選中鑒定了USP21，一種用于控制FOXM1豐度的去泛素化酶。USP21增加了FOXM1的穩(wěn)定性，USP21在體內(nèi)和體外結(jié)合和去泛素化FOXM1，表明存在直接的酶-底物關(guān)系。敲低USP21會(huì)下調(diào)FOXM1轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程的顯著延遲。值得注意的是，USP21敲低使BLBC細(xì)胞系和小鼠異種移植腫瘤對(duì)紫杉醇敏感（紫杉醇是BLBC治療中的一種抗有絲分裂的藥物）。USP21是BLBC患者腫瘤中最常高表達(dá)的去泛素化酶，其高表達(dá)與FOXM1蛋白的上調(diào)同時(shí)發(fā)生?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明USP21在FOXM1高、USP21高BLBC的增殖和治療中的作用。

研究?jī)?nèi)容

1.USP21結(jié)合并改變FOXM1豐度? ? ?

????????對(duì)HeLa細(xì)胞的免疫印跡（IB）分析顯示，F(xiàn)OXM1的豐度隨著PR-619（一種小分子、非特異性泛DUB抑制劑）濃度的增加而明顯下降。這表明FOXM1的降解可以被DUBs主動(dòng)阻止。用不同DUBs siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，隨后通過IB分析顯示USP21敲低可降低內(nèi)源性FOXM1的水平。相應(yīng)地，USP21的異位表達(dá)明顯增加了293T細(xì)胞中FOXM1的豐度。這些結(jié)果表明，F(xiàn)OXM1的豐度受USP21的調(diào)節(jié)。

????????為了確定USP21表達(dá)的變化對(duì)FOXM1穩(wěn)定性的影響是否是由于這兩種蛋白之間的相互作用，作者在293T細(xì)胞中異位表達(dá)FLAG或HA標(biāo)記的FOXM1b和Myc-USP21質(zhì)粒。針對(duì)Myc-USP21或HA-FOXM1b都能通過共免疫沉淀（co-IP）檢測(cè)到FOXM1和USP21之間的相互作用。此外，使用針對(duì)USP21的抗體檢測(cè)了內(nèi)源性FOXM1和USP21之間的相互作用。為了確定USP21識(shí)別的FOXM1的結(jié)構(gòu)域，將一系列Myc-FOXM1b片段與FLAG-HA-USP21共同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，并通過共同IP評(píng)估相互作用。針對(duì)Myc-FOXM1b和FLAG-HA-USP21的IP結(jié)果表明，USP21與包括FOXM1氨基酸321-400的區(qū)域結(jié)合。

研究結(jié)論：USP21和FOXM1直接相互作用，這兩種蛋白質(zhì)之間存在酶-底物關(guān)系。

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2.FOXM1是USP21底物? ? ?

????????為了確定USP21敲低或過表達(dá)對(duì)FOXM1的影響是否是通過蛋白酶體降解介導(dǎo)的，用蛋白酶體抑制劑MG132處理HeLa細(xì)胞。IB分析證實(shí)，USP21敲低導(dǎo)致的FOXM1不穩(wěn)定部分通過蛋白酶體抑制得以恢復(fù)。DUB通過去除多聚泛素鏈，特別是K48和K11拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來(lái)對(duì)抗蛋白酶體降解。為了確定USP21是否影響FOXM1上的多聚泛素鏈綴合，作者在體內(nèi)分析了FOXM1泛素化。293T細(xì)胞用HA-FOXM1b和6xHIS-FLAG-泛素結(jié)合WT USP21或USP21的催化失活變體（USP21 C221A）轉(zhuǎn)染。通過IB進(jìn)行分析表面，多泛素化的FOXM1在具有內(nèi)源性USP21表達(dá)水平的條件下很容易檢測(cè)到。然而，當(dāng)USP21 C221A過表達(dá)時(shí)，多泛素化FOXM1的水平恢復(fù)到接近在對(duì)照條件下觀察到的水平。

????????因?yàn)閁SP21可以直接結(jié)合和去泛素化FOXM1，作者接下來(lái)評(píng)估了USP21對(duì)FOXM1穩(wěn)定性的影響。為了評(píng)估USP21對(duì)FOXM1半衰期的影響，在293T細(xì)胞中過表達(dá)USP21 WT或USP21 C221A以及在BLBC MDA-MB-231細(xì)胞中敲低USP21以阻止蛋白質(zhì)翻譯后，通過IB評(píng)估FOXM1水平。在放線菌酮處理后的前4小時(shí)內(nèi)，F(xiàn)OXM1豐度以相似的動(dòng)力學(xué)下降，但USP21 WT過表達(dá)可以保護(hù)剩余群體免于降解至少12小時(shí)，而USP21 C221A細(xì)胞中的FOXM1豐度下降速度甚至比對(duì)照組細(xì)胞更快。

研究結(jié)論：USP21控制FOXM1泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解。

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3.USP21影響FOXM1轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和增殖? ? ?

????????FOXM1是一組基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這些基因參與建立和確保通過有絲分裂成功的G2/M過渡和進(jìn)展。這種轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)已被證明會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期延遲、有絲分裂缺陷和染色體錯(cuò)誤分離。鑒于以上發(fā)現(xiàn)，作者認(rèn)為調(diào)節(jié)USP21水平會(huì)對(duì)FOXM1轉(zhuǎn)錄輸出產(chǎn)生相應(yīng)的影響。作者將293T細(xì)胞與USP21和基于FOXM1熒光素酶的轉(zhuǎn)錄活性報(bào)告基因（6x-DBE）共轉(zhuǎn)染。與對(duì)照相比，USP21過表達(dá)顯著增強(qiáng)了FOXM1依賴性轉(zhuǎn)錄活性，表明USP21過表達(dá)增強(qiáng)了FOXM1豐度。相應(yīng)地，在siRNA轉(zhuǎn)染以敲低MDA-MB-231細(xì)胞中的FOXM1或USP21后，與對(duì)照相比，USP21的敲低導(dǎo)致所有FOXM1轉(zhuǎn)錄目標(biāo)減少。此外，在用pINDUCER20慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以引入強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的USP21轉(zhuǎn)基因的MDA-MB-231細(xì)胞中，USP21過表達(dá)并未顯著改變FOXM1 mRNA水平。總之，這些數(shù)據(jù)表明由于USP21引起的FOXM1水平變化對(duì)FOXM1轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)具有下游影響。

????????作者接下來(lái)試圖確定有絲分裂進(jìn)入的動(dòng)力學(xué)是否會(huì)因USP21丟失而受到干擾。結(jié)果表明FOXM1或USP21的敲低顯著損害了細(xì)胞周期進(jìn)展為有絲分裂釋放后22小時(shí)，在FOXM1和USP21敲低的群體中，分別只有1.6%和10.9%的細(xì)胞呈P-H3陽(yáng)性。相比之下，有40.7%的對(duì)照細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入有絲分裂。在USP21敲低的FOXM1過表達(dá)群體中，有絲分裂發(fā)生得到顯著恢復(fù)。這些結(jié)果證實(shí)了先前的報(bào)道，即FOXM1敲低會(huì)損害有絲分裂發(fā)生。最后，作者假設(shè)FOXM1和USP21敲低導(dǎo)致的有絲分裂發(fā)生減慢會(huì)導(dǎo)致增殖相應(yīng)減少。數(shù)據(jù)也表明BLBC細(xì)胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖顯著受損。此外，在MDA-MB-231細(xì)胞中FOXM1b的異位、多西環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)部分地恢復(fù)了由USP21敲低引起的增殖受損。

研究結(jié)論：USP21的下調(diào)可以通過下調(diào)FOXM1穩(wěn)定性和FOXM1轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的下游效應(yīng)來(lái)影響整體增殖。

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4.USP21擴(kuò)增與BLBC中的FOXM1蛋白水平和腫瘤增殖相關(guān)

????????FOXM1上調(diào)已在各種癌癥中報(bào)告。在乳腺癌中，作者發(fā)現(xiàn)FOXM1 mRNA表達(dá)與乳腺癌亞型顯著相關(guān)，在BLBC亞型中表達(dá)最高。作者接下來(lái)分析了FOXM1被激活的腫瘤的增殖能力。單個(gè)腫瘤的增殖評(píng)分與FOXM1表達(dá)高度顯著相關(guān)，因此作者得出結(jié)論，僅FOXM1水平增加是腫瘤增殖的有力指標(biāo)。接下來(lái)，作者分析了癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集中乳腺腫瘤中所有人類DUB的拷貝數(shù)變化和mRNA表達(dá)。USP21擴(kuò)增與增殖評(píng)分和BLBC亞型均顯著相關(guān)。相應(yīng)地，對(duì)代表正常樣、管腔和BLBC乳腺癌亞型的細(xì)胞系中FOXM1和USP21蛋白表達(dá)的IB分析顯示，F(xiàn)OXM1和USP21的表達(dá)在BLBC亞型中是獨(dú)特的。FOXM1是TCGA中通過反相蛋白質(zhì)陣列(RPPA)分析的227種蛋白質(zhì)之一。這為作者提供了檢查乳腺癌中FOXM1蛋白水平的豐度及其與腫瘤中USP21 mRNA表達(dá)的關(guān)系的機(jī)會(huì)。因?yàn)樽髡叩慕Y(jié)果表明FOXM1蛋白被USP21翻譯后穩(wěn)定，作者檢查了FOXM1蛋白水平作為USP21表達(dá)的函數(shù)。結(jié)果FOXM1蛋白是USP21擴(kuò)增腫瘤中最顯著上調(diào)的蛋白。作者還使用基因集富集分析(GSEA)探究了114個(gè)FOXM1靶基因的精選列表是否與USP21擴(kuò)增相關(guān)。該分析揭示USP21擴(kuò)增的乳腺癌中FOXM1轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)烈富集。

研究結(jié)論：USP21擴(kuò)增與BLBC中的FOXM1蛋白水平和腫瘤增殖相關(guān)。

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5.USP21影響B(tài)LBC中的紫杉醇反應(yīng)? ? ? ?

????????除了在癌癥增殖中的作用外，F(xiàn)OXM1的高表達(dá)還歸因于乳腺癌對(duì)鉑類藥物和紫杉類的抗性并與轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良相關(guān)。作者探究了USP21敲低是否可以以FOXM1依賴性方式增加對(duì)紫杉醇的敏感性。幾種BLBC細(xì)胞系細(xì)胞被用來(lái)評(píng)估對(duì)照組（siFF）、FOXM1敲低組和USP21敲低組細(xì)胞暴露于DMSO或紫杉醇72小時(shí)后的生存能力。在所有被評(píng)估的細(xì)胞系中，與未用紫杉醇處理的細(xì)胞相比，用紫杉醇處理的FOXM1和USP21敲低條件的存活率明顯下降。因此，雖然在對(duì)照條件下USP21（和FOXM1）的敲低會(huì)損害這些細(xì)胞系中的每一個(gè)的增殖，但當(dāng)USP21敲低與紫杉醇治療相結(jié)合時(shí)，存活率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低?？紤]到當(dāng)單獨(dú)用紫杉醇處理時(shí)SUM149細(xì)胞的生存能力沒有顯著降低，這尤其引人注目。FOXM1敲低和USP21敲低導(dǎo)致細(xì)胞活力的顯著差異以及當(dāng)FOXM1在USP21缺失條件下過表達(dá)時(shí)細(xì)胞活力的顯著恢復(fù)表明FOXM1顯著促進(jìn)紫杉醇敏感性并且是關(guān)鍵的USP21底物，導(dǎo)致在USP21敲低細(xì)胞中觀察到的紫杉醇敏感性差異。

????????基于USP21的敲低使細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感的認(rèn)識(shí)，作者接下來(lái)探究BLBC細(xì)胞在小鼠異種移植模型中被USP21敲低后對(duì)紫杉醇的反應(yīng)如何。SUM149是一種BLBC細(xì)胞系，在小鼠異種移植物中對(duì)紫杉醇不敏感。作者用表達(dá)對(duì)照shRNA或shUSP21的慢病毒轉(zhuǎn)染SUM149細(xì)胞，并植入NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪墊中，然后每周兩次給小鼠施用紫杉醇或藥物。結(jié)果顯示，由于USP21敲低和紫杉醇，平均腫瘤體積在六周內(nèi)從對(duì)照條件下的1,101 mm3減少到414 mm3。

研究結(jié)論：抑制USP21可能通過抑制增殖和增強(qiáng)由FOXM1激活驅(qū)動(dòng)的化療耐藥效應(yīng)，起到BLBC的治療效果。

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結(jié)論與討論

????????在這里，作者展示了FOXM1和USP21之間的底物-酶關(guān)系。USP21調(diào)節(jié)FOXM1的豐度，結(jié)合并去除FOXM1的多聚泛素鏈，從而保護(hù)其免受蛋白酶體降解。作者還表明USP21表達(dá)可以改變FOXM1轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)調(diào)節(jié)有絲分裂時(shí)間和增殖有影響。此外，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1和USP21在BLBC中被特異性上調(diào)，并且USP21的敲低可以提高對(duì)紫杉醇的敏感性，這主要是通過其與FOXM1的關(guān)系。因此說(shuō)明，USP21通過維持FOXM1的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，并且抑制USP21在治療具有FOXM1高、USP21高表達(dá)特征的BLBC方面具有治療潛力。

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原文鏈接：

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2211124719302335